1、飼料中三聚氰胺的檢測方法三聚氰胺（melamine）簡稱三胺，學名三氨三嗪，是一種重要的氮雜環有機化工原料，在飼料工業中 作為粘合劑使用。目前國際上通常采用凱氏定氮法測定飼料中粗蛋白質的含量。即求出氮的含量，再乘 以一定的換算系數（通常用6. 25系數計算）得出蛋白質含量。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，每 個三聚氰胺分子中都含有6個氮原子，而在原料的粗蛋白檢測過程中，用濃硫酸消化過程可以將三聚氰 胺分解掉但在最后的計算中，三聚氰胺中的氮原子即可提高粗蛋白的比率，造成蛋白含量虛假增高。 因此只要在飼料中添加一些含氮量高的化學物質，就可在檢測中造成蛋白質含量達標的假象。飼料中非 法添加化工原料

2、可以提高蛋白質檢測數值，而用全氮測定法測飼料和食品中的蛋白質含量時根本不能 區分這種偽蛋白氮。在飼料中少量添加三聚氰胺即可大大提高蛋白含量。l三聚氰胺的性質1. 1物理性質分子式C3N6H或C3N3（NH2）3分子量126. 12,為純白色單斜棱晶體，無味，低毒，密度1. 573 g/cm3 16C。常壓熔點354E （分解）；快速加熱升華，升華溫度300C。溶于熱水，微溶于冷水，極 易溶于熱乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等。在一 般情況下較穩定，但在高溫下可能會分解放出氰化物。1. 2化學性質三聚氰胺的水溶液呈弱堿性（pKb=8），與鹽酸、硫酸、硝

3、酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺鹽。在中性或微堿性情況下，與甲醛縮合而成各種羥甲基三聚氰胺，但在微酸性環境中（pH值5. 5-6 . 5）與羥甲基的衍生物進展縮聚反響而生成樹脂產物。在強酸或強堿液中，三聚氰胺發生水解，胺基逐步被羥 基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺與醛類反響生成加成化合物，其 中三聚氰胺與甲醛水溶液的反響是最重要的反響。2飼料中三聚氰胺的檢測方法2. 1試劑盒檢測法fELISAI利用萃取液通過均質與震蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進展免疫測定。2. 1. 1樣品處理稱取1. 0 g均質過的飼料樣品于離心管中，參加 10 ml甲醇充分混合,15 000

4、 r /min離心10 min, 取上清液1 ml于小試管中用氮氣吹干，參加 2. 5 ml 10 %甲醇和20 mmol/1 PBS溶液充分溶解，移取 100ul進展分析。2. 1. 2 ELISA檢測步驟將所有試劑與樣品提取液上升溫度至室溫（2028E ），用前按試劑盒的要求稀釋所用試劑.取相應 數量的微孔條，插入框架，吸取100ul標樣或樣品提取液到相應的微孔，每孔參加50ul三聚氰胺HRP酶標記物，輕輕混合60 s，孵育30 minf20-28 C。然后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用250ul洗液洗板5次；在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干；每孔參加100ul底物溶液，孵育30 min（2

5、0-28 C），每孑L參加100ul終止液，用酶標儀讀取在450 nm下的吸光值。2. 1. 3作圖以所獲得的標準和樣品吸光值的平均值除以0標準的吸光值再乘以100為縱坐標，以三聚氰胺濃度半對數為橫坐標作標準曲線，確定被測樣品的濃度。2. 2液相檢測法和氣相色譜一質譜檢測法試樣中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，將提取液離心后經混合型陽離子交換固相萃取柱凈化， 洗脫物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色譜儀進展測定；凈化后的洗脫液用氮氣吹干，用N, 0一雙三甲基硅基三氟乙酰胺fBSTFA）衍生化，以氣相色譜一質譜聯用儀進展定性和定量測定。2. 2. 1樣品處理稱取5. 00 g試樣，準確參加50 m

6、l三氯乙酸溶液（10g/l），參加2 ml乙酸鉛溶液（22g/l），搖勻， 超聲提取20 min，靜置2 min，取上層提取液約30 ml轉入離心管，在12 000 r /min離心5 min。分 別用3 ml甲醇、3 ml水活化混合型陽離子交換固相萃取柱。準確移取10 ml離心液分次上柱，控制過柱速度在1 ml /min以內再用3 ml水和3 ml甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，抽干后用5%氨化甲醇3 ml洗脫，洗脫液在50T下氮氣吹干，準確參加2 ml甲醇溶液，渦漩振蕩1 rain，過0. 45 I . zm膜，用高效液相色譜儀測定三聚氰胺含量。2. 2. 2衍生根據液相的定量結果將洗

7、脫液稀釋成濃度約為 0. 5 Ixg /ml。分別吸取稀釋液0. 5 ml用氮氣吹干， 參加250ul吡啶和250ul衍生試劑，加蓋，混勻，70 cc反響30 min,同時吸取0. 5ug/ml的標準溶液 0. 5 ml做同步衍生，用氣相色譜一質譜聯用儀確證。2. 2. 3儀器條件液相色譜條件紫外檢測器，波長 240 nm；色譜柱ZORBAX clipse XDB-C8,柱長150 mm內徑4. 6 mm，粒度5 Ixm;流動相A: B=93: 7（A:稱取庚烷磺酸鈉2. 02 g和檸檬酸2. 10 g溶解，定容至1 L ; B:乙腈）， 流動相流速1. 0 ml /min，進樣量10ul。氣

8、相色譜一質譜聯用儀條件色譜柱 VF-5ms 30 m 0. 25 mm 0. 25um capillaiy column ;進樣口溫度：250°C ；進樣量：1ul ;柱 溫：起始溫度75C，保持1 min，以30/min升溫至300C，保持2 min ;載氣、氦氣流速：1-3 ml / min；傳輸線溫度：280C ;溶劑延遲5. 5 min ; EM電壓：高于調諧電壓200 V，離子阱溫度：220C; 選擇離子監測：fM/Z）99、171、327、342。2. 2. 4標準溶液的制備精細稱取三聚氰胺標準品0. 100 0 g,置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶液溶解、稀釋至刻度，

9、得到 濃度為1 000 Ixg /ml的標準儲藏液；吸取標準儲藏液 10. 00 ml于100 ml容量瓶中，用甲醇溶液定容 至刻度，得到濃度為100ug/m1的標準中間液；分別吸取標準中間液5、10、25、50 ml于100 ml容量瓶中，用甲醇溶液定容，得到濃度分別為 5、10、25、50、100ug/ml的標準工作液。2. 2. 5結果計算計算公式：X=C- Vn/m式中：X試樣中三聚氰胺的含量（mg/kg）;C 標準曲線上查得的試樣中三聚氰胺的濃度（ug / m1）；V 凈化后參加的甲醇溶液體積（m1）;m試樣質量（g1 ;n稀釋倍數。3工業上三聚氰胺的檢測方法3. 1苦味酸法將水參加

10、試樣，加熱溶解后，參加苦味酸溶液，稱量所生成的苦味酸三聚氰胺沉淀的質量，即測得三聚氰胺純度含量。稱取試樣，置于500 ml錐形瓶中，同時參加水，加熱溶解：冷卻后，參加酚酞指示液3滴，假如顯色，參加硫酸溶液，直至溶液顏色消失，假如有不溶物，需過濾，水洗；把濾液和洗液合并，移入500 ml 容量瓶中，加水至刻度，仔細振搖混合后，準確吸取100 ml置于500 ml燒杯里：將此溶液加熱至80C,另參加已加熱至80 cC的100 ml苦味酸溶液，冷卻至室溫后，保持在 15°C以下約8 h:用已恒重的玻砂 過濾器過濾，然后，先用約100 ml苦味酸三聚氰胺的飽和溶液洗滌，再用水洗：烘干玻砂過濾

11、器，置于 枯燥器中冷卻后，稱量求得沉淀物質量。3. 2升華法在升華裝置中將試樣在負壓下進展加熱，讓三聚氰胺完全升華后，稱其殘渣量，即測得三聚氰胺純 度。將樣品置于預先枯燥了的且質量的試樣容器里；將試樣容器置入減壓升華裝置內，待完全密閉后， 開啟真空裝置緩緩吸引，并調節裝置內的溫度，經2 h升華完畢：取出試樣容器，冷至室溫后，稱量試樣容器的質量。3. 3電位滴定法上述兩種測定方法準確度均較高， 但操作繁瑣，分析時間太長，有人推薦采用電位滴定法。首先 測定三聚氰胺溶液中總固體的含量，稱取樣品于200 ml燒杯中，參加100 ml蒸餾水，放于石棉網的電爐上加熱.在沸騰的情況下攪拌溶液，使試樣完全溶解

12、。在電磁攪拌狀態下，用硫酸標準溶液滴定熱溶 液至pH值為5左右。流水冷卻溶液至室溫，滴定，每次準確參加0. 1 ml硫酸標液，并記下相應的pH值，直至pH值約為3。計算出等當量點時消耗硫酸標液的體積。計算公式：Me=Sx6 307x VxF/M 式中：M溶液中三聚氰胺的含量（）;S溶液中總固體的含量（）;V 等當量點時消耗硫酸標液的體積（m1）;F0 . 5 mol /1硫酸標液的校正系數：M滴定時所標取總固體的質量fmg）;6. 307換算系數。飼料中三聚氰胺檢測【樣品前處理】 稱取飼料樣品0.40g（準確到0.01g），置于10mL具塞刻度試管中，參加7mL19三氯乙酸，渦旋混勻，超聲提取

13、10min ;再參加0.5mL 10%乙酸鋅溶液和 0.5mL 10%亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻，用1爐氯乙酸定容至滿刻度線；樣品經10000rpm，離心5min;取5mL上清液作為待凈化液。依次用3mL甲醇和5mL水活化SPE柱；將待凈化液用水稀釋至10mL,轉移至固相萃取柱，依次用 3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL 5%氨化甲醇溶液洗脫。整個過程控制流速不超過1mL/min。洗脫液50C卩m油系濾膜，供HPLC分析。【儀器與試劑】 UV1201紫外-可見檢測器；P1201高壓恒流泵；ZWII型色譜柱溫箱；Elite MSP色譜柱（5卩x 150mm；三聚氰胺標準品（99%）;陽

14、離子交換固相萃取柱 （Thermo Retain-CX, 60mg, 3mL）；氫氧化鈉、檸檬酸（分析純）、辛烷磺酸鈉（色譜純）、甲醇（色譜純）、 乙腈（色譜純）、乙酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、三氯乙酸（分析純）、氨水（25%）、 超純水（二次過濾），各種飼料樣品。【試劑配制】 三聚氰胺標準儲藏液 稱取50.0mg（準 確到0.1mg）三聚氰胺標準品，用20%甲醇溶解并定容至 50mL容量瓶中，該溶液濃度為1mg/L, 于4C冰箱儲存，有效期 3個月。 使用時，用流動相將儲藏液分別稀釋到不同濃度即可。標準系列工作曲線包括 1mg/mL 5mg/mL 10mg/mL 25mg/mL 5

15、0mg/mL。1% 三氯乙酸 溶液 稱取10.0g三氯乙酸，加水定容到 1000mL。 10%乙酸鋅溶液 稱取10.0g乙酸鋅， 加水定容到100mL。10%亞鐵氰化鉀溶液 稱取10.0g亞鐵氰化鉀，加水定容到100mL 氨水甲醇溶液 量取5mL氨水溶液，參加100mL甲醇混合均勻。【分析方法】 色譜柱：Elite MSP5卩x 150mm）流動相：乙腈/緩沖鹽=10/90（緩沖鹽含10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸 鈉，調節pH至3.0）流速：1.5mL/min波長：240nm室溫：控制在2228 C之間 進樣量：【實驗結果】1.標準品譜圖10mg/L的三聚氰胺標準品的實驗譜圖如M ela c

16、m ne藥-2Q-叫10-下:10Retention lime(min)20圖 1 10mg/L標準溶液譜圖2.重現性采用此方法分析三聚氰胺，連續進樣重現性良5 14.638 206.12 6 14.616 206.36 7 14.586 207.66 8 14.620 207.55 9 14.627 207.84 1014.659 207.83 11 14.689 207.71平均值14.65 206.97 RSD/% 0.23 0.42 3.線性相關性測試如圖3、4，在所測試濃度X圍內，三聚氰胺標準品具有良好的線性相關性，相關系數SOmg L 25mg L lOmg I 5rrg/t_ I

17、nnq/'ljiielfimmehd：idl r 1_ AVJTL51015120均為 0.9999。Retention time(nnin)圖3不同濃度標準品疊加譜2(X)0 = 0,99991G0D-I10實驗的校準曲線 4.加標回收率 圖5比照可知，在標準品出峰位置，樣品沒有明顯出峰, 故該樣品為陰性樣品或三聚氰胺含量低于該系統的方法檢出限，用此樣品做加標回收率實驗，結果見表0 00000007 G 5 4 3 2 151015O圖5未知樣品、空白與樣品加標疊加譜圖表2飼料樣品的加標回收率結果加標量（mg/kg）平行實驗一 （mg/kg） 平行實驗二（mg/kg） 平均值（mg/

18、kg） 回收率 % 1.0 1.05 1.03 1.04 104.0%5.0 4.36 4.51 4.44 88.8% 10.0 9.63 9.25 9.44 94.4% 25.0 21.97 21.77 21.87 87.5%如表2結果，在4個不同的加標水平下，該方法三聚氰胺的加標回收率在87.5%104.0%之間，說明方法準確性良好。5.檢測限、定量限 依據噪聲值，按3倍信噪比，計算其理論檢出限，按10倍信噪比，計算其理論定量限如下：計算方法 檢出限(mg/kg)定量限(mg/kg)校正曲線方法0.046 0.153 6.系統穩定性測試同一飼料加標樣品，一分為三，采用所述方法連續處理三次，

19、并測試譜圖計算結果，如圖6和表3所00*0006 ® 4 m 2 f>§QUBffiJ5101520圖6樣品分析疊加譜圖表3平行樣品測試結果平行實驗一(mg/kg)平行實驗二(mg/kg)平行實驗三(mg/kg) 平均值(mg/kg) RSD% 4.36 4.51 4.42 4.43 1.47同一樣品，平行測試 3次，測試三聚氰胺結果 RSD值為1.47%，說明該系統穩定性良好。 7.實際樣品定性和定量結果 采用所述方法，對飼料樣品進展了分析，譜圖如下，結果如表4。表4飼料實際樣品測試結果樣品編號四五六七三聚氰胺含量(mg/kg)未檢出未檢出0.6325.07 770

20、.47 1.41未檢sfira昌 3圖7飼料樣品一150J1403&2010-ijll口 _jJ* i-. A1pi-|fr*iC514B20分析譜圖卜上.3町紅：訕-伽：|'圖8飼料樣品二分析譜2A>E0sMelamine2DIDRetention time(min)飼料樣品三分析譜(ae)ch呂«rIIIr:f!05101520Retention time(min)10飼料樣品四分析譜- H 一一 =! 50如3020>uoumtnMelamine10-D610162CRetention圖11飼料樣品五分析譜>&而匸 6(5MelEJin

21、ine05101520Retention time(min)圖12飼料樣品六分析譜C6ID1620Retention(ime(niEn)13飼料樣品七分析譜圖附件1: HyperSep Retain-CX 產品介紹 產品名稱：HyperSepRetain-CX 填料基質：磺酸基功能化的聚苯乙烯 /二乙烯基苯萃取柱規格型號：60mg/3mL產品貨號：60107-303 產品圖片：生產商:Thermo FisherScientific產品特點：三聚氰胺前處理堿性、非極性分析物的均可保存從生物樣品中萃取堿性藥物的理想選擇附2:飼料中三聚氰胺檢測依利特全套配置清單測試用分析方法包序號名稱規格級別數量產地1檸檬酸分析純50g國產2辛烷磺酸鈉色譜純 60g國產3三聚氰胺標準品 純度99.0% 1克美國4 一次性注射器（200支/包）2mL 1 包國產5水系濾膜（100片/盒）m1盒某某6有機系濾膜（100片/盒）m1盒某 某7針筒式有機相過濾器（100支/包）250mm 5卩m1支 依利特9混合型陽離子固 相萃取柱