1、食品中植物性成分檢驗方法-洋蔥成分之定性檢驗哪年10月舁1胃授金字諂0阿盹03的號公告訂定102年11 J 28 H部授食了第102邸1027號公;1靜匣I”適用範圍：本檢驗方法適用於食品屮洋蔥成分之定性檢驗。2.檢驗方法：檢総槌DNA萃取後、以即時聚合輸鎚吃應（real-lime polymerase chain reaction, real*timePCR ）之方法。2.L工作環境：工作平臺笳寬敝7累淨 ' 光線良好*檢瞪前就理檢US DNA抽取、real-timePCR試刮配製及檢驗過程皆需有證隔空間-醒免交義污染。ReaUime PCR試簾之配製應於 無菌操作臺內進行-22 裝

2、K(Jtl>2.2.1. 即時聚合陽鍵反應器：ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 或 Roche LightCycler 或同級品。2.2.2. 冷凍乾燥裝說:溫度可逹4) C以下-IX空度可逐133 mBar以下，供檢乾燥用。223.振盪空粉碎機:Retsch MM200 -或同級品。2.2.4. 貝空乾燥裝H：供DNA乾燥用。2.2.5. 高壓滅菌釜。2.2.6. 無閑操作臺。227.加熱振盪器:具55°C溫控及振盪功能。2.2.& 微碓冷凍離心機(Micro refrigerated centrifuge):可達

3、20000 x g，並具 4"C 溫押珈g。2.2.9.離匚錢：供各式微hW心TT離心用。2210.分光光度計：具波艮260 nm、280 nm 2.2.11.冷凍設備:具冷藏及凍結功能。2212.旋渦混合器(Vortexmixer)。2.2.13. 酸鹼度測定儀(pH meter)。2.2.14. 水浴裝進:溫差±lt以內者。2.2.15. 天平：彼人稱巫雖爲2000 g，馥敏度爲0g :般人稱重就爲100g>靈敏度爲I mg。 註1 :本方法所使用或提及之產品品牌不代衣爲同類產品中放好者：反之，未便用或提及之產品品牌亦不代表爲同類產品中餃差者2.3. 試藥2.3.

4、DNA抽取用試樂：乙醉(96-100%)採分于生物分析級試集：適用於植物DNA抽取 之市魯套組。2.3.2. Real-time PCR 用"2.321.鑑別試驗用引子及探針植物共通性荃因(標的基因:5.8S ribosomal RNA >供作內部對照基因)弓 |子 F ： 5.8SF. 5'ACTCTCGGCAACGGATATCTYG3' 引子 R ： 5.8SR, 5*-GGCGCAACTTGCGTTCAAAR-3, 探針 P : 5.8S P. 5f-(FAM>-TCGATGGTTCRCGGGATTCTGCAATTCA-(TAMRA>-3rPC

5、R增幅產物人小116 bp.2. 蔥及洋恿:(標的基因：internal transcribed spacer. ITS)弓 |子 F ： AFaF. 5 ACATACTGTGAGTGATGGCGGATGTGGAG-3*引子 R ： AFaR.5、TTCGCCGCGCGTAGACCTAACGACA3'探針 P : AFaP. 5XFAM>TTGACCCTCCGTGCCTTAATTGWTAMRAXTPCR增輜產物大小99 bp.3. 洋蔥(BWjiSW : cytoplasmic specific DNA)引子 F ： ONIF, 5'-TCTAGATGTCGCATCAGT

6、GGAATCC-3, 弓 | f- R ： ONIR, 5YGTGACAACTCCTCITCC3， 探針 P : ONIR 5'-(FAM>-TGCAGGCTCAGGCGCTG(TAMRARPCR增幅產物大小174 bp註2 ： 1合成之引子及探針.拆封後.以無菌去離子水稀釋成適當濃度分裝後航於20 C貯存備用另用邂光(呆存。探針5端採用6-carboxy-fluorescein(FAM)標Ji! 3,端採用 6-carboxytctramcthykrhodaminc (TAMRA) tXid 02. 植物類內部對照棊因引子及探針之序列中，Y爲混合鹼塔代碼(CAT) *表示同時含

7、C及T ： R爲混合鹼坯代碼(A/G) *表示同時含A及G。2.3.22 TaqMan Universal PCR Master Mix (適用於 AB1 PRISM 7900HT Sequence Detection System )本試制內含real-time PCR所需去錢核糖核甘三確酸、聚介的爭，便用時添加弓I子、探針及待測棚ISDNA。2.323. LiglitCyclerK l astStart DNA Master HybProbe (適用於 Roche LightC'ycler)本跡內含real-time PCR所需公氣核糖核甘 瀾酸、聚合S躊，且內附25 mM 氯化&

8、#174;諮液，使用緜躺【子、探及待測M DNA。2.3.3. 對照用物質:洋蔥空織，或使用衛生福利部食品樂物管理署提供編燒S205之參號質 作爲對照用物質。2.4. 器具及材料2.4.1. 吸管(Pipette) ： 10pL、20此、100此、200此及 1000pL*2.4.2. 吸管熾(Pipette tips) ： 10 pL、20 此、200 此及 1000 yL。2.4.3. 離心管：200 “L、600 心 1.5 汕及 2 mL。2.4.4. PCR 反應管：200 pL 2.4.5. PCR 玻璃毛細管：Roche LightCycIcr 般用2.4.6. 玻璃或普強瓶：5

9、0 mL、100 mL、250 mL、500 mL、1000 mL 及 2000 mL 2.4.7. 型勝離心管：50mL。註3 :使用之觀曜或玻璃器1111均爲無DNase污染-2.5. Real-time PCR 溶液之配製<H4>2.5.ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 鑑別試驗用5pM 弓 |子 F 1.25pL5pM 弓子 R1.25 pL3.3 yM 探針 P1.7pLTaqMan Universal PCR Master Mix12.5gL晰DNA溶液（總尿100 ng） 5.0此無菌去離子水3.3pL總加25.0p

10、L2.5.2. Roche LightCycler 鑑別試驗用5pM 引子 F1.5pL5pM 弓 |子 R1.5pL33 gM 探針 P1.5pLLightCyclerx FastStart DNA Master HybProbe2.0pL25 mM氯他溶液2.4pL瞰 DNA 溶液（總笊 100 ng） 5.0PL無菌去離子水6.1PL總體秋20.0pL註4 : Real-time PCR溶液應間於冰浴中配製。2.6. 檢fl5 DNA之製備261.檢惴之處則心忌燥檢惴直接以粉碎機硏瞎成卻血溼狀檢閃純冷凍乾慄處理後，再以粉碎機硏 廨成粉-檢115需貯存於乾燥及冷凍環境中註5 ： I.硏桝檢

11、fl®時應於區隔之空間進行，避免交叉污染2.溼狀檢燦乾燥時間町視乾燥程度澗整2.6.2. DNA之軸馭採用適用於帕物DNA抽取之市售套組，依套組操作說明步驟抽取DNA 押馭之 NA溶液收集至已滅菌之1.5 ml.離心管，作爲檢DNA原液依263.節測定DNA 漑度後，置於20°C冷凍保存。2.6.3. DNAiQ度測定及純度判斷収適就之檢惴DNA原液，以無歯去離水做適當倍數之稀釋，分別測定260 nm 及280 nm之吸光値(O.D.) 以波艮260 nm吸光値乘50 ng/ML及稀釋倍數，即爲檢 IB. DNA原液減度DNA溶液純J箜則以O.D.MO.D.緲比値作判斷其比

12、値應介於1.7 2.02.7. Real-time PCR 谿為蹄2.7.1. Real-time PCR 操作步驟2.7.1.1. Real-time PCR AB1 PRISM 7900HT Sequence Detection System以無菌去離F水適常稀釋檢IB DNA原液、引子及探針備用。取PCR反應 管，依照 2.5.1.®配製 PCR 溶液，依序加入 TaqMan Universal PCR Master Mix、稀 釋過之引了及探針混合均勻後，分裝20 pL入PCR反應管中，各別加入檢11?DNA溶液5 PL 再將PCR反應管閥於離心機中，以200 x g瞬離心，

13、移入real- time PCR反應器，依卜列條件進行反應。同時另製作止反應及負反應對照組步驟m時間I.熱活化50C2 min2.放初酗95cC10 min3.刪95C15 sec4.黏接、60C1 min步驟3至步驟4 共進行45個循環反應。5.冷卻35cC45 sec2.7.1.2. Real-time PCRRoche LightCycler以無菌去離子水適常稀釋檢肉DNA原液、引子及探針備用。取PCR反應 管，依照 .節配製 PCR 溶液 » 依序加入 LightCycler* FastStart DNA Master HybProbe、25 mM紙化經溶液、稀釋過之引子及探

14、針，混合均勻後，分裝15此 於玻璃毛細管中，各別加入檢閒DNA溶液5讓，再將毛細管筒於離I機中，以 800 x g瞬|罰離心，移入real-time PCR反應器，依F列條件進行反應。同時另製作 正反應及負反應對照組-步驟時冏1.眾初刪95C10 min2.助95C5 sec3.和接60C25 sec4敏72cC8 sec步驟2至步驟4，共進行45個循環反應。5.冷卻35cC45 sec2.7.2. Real-time PCR 螢光分析檢fl5 DNA經real-time PCR反應後，直接從real-time PCR反應器上之養矗觀察探 針所產牛之螢光增幅曲線，即可判讀反應結果。同時另測試正

15、反應及負反應對照組。2.7.3. 磁檢fl? DNA需同時進行內部對照基因、蔥及洋蔥標的基因、蔥標的基因之RT-PCR 測試。檢IB DNA之real-time PCR增幅產物螢光分析圖與止反應對照組螢光分析I謝進 行相互比對，當檢IB DNA與I限應對照組之real-time PCR螢光分析WI均川禺!經111探 針所產生之螢光增軸曲線，即確認該njal-time PCR幅產物爲洋蔥之塔因片段，可確 認該檢體中含有洋蔥成分。2-7.4.判定（附圖）2.7.4. i.以real-time PCR測試爲內部對照站因負反應，表示不含植物成分"2.7.42 以real-time PCR測試爲