1、A群腦膜炎球菌多糖菌苗制造及檢定規(guī)程A群腦膜炎球菌多糖菌苗系用 A群腦膜炎球菌液體培養(yǎng)后， 經(jīng)提純獲得的多糖抗原凍干制成。供預防A群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎之用。1菌種1.1 菌種來源制造用的菌種及檢定菌種用的各種診斷血清，由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2 菌種檢定1.2.1 形態(tài)及培養(yǎng)特性將待檢的菌種接種在含10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基上，腦膜炎球菌在25C不生長。3537C二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)1620小時，涂片鏡檢應為革蘭氏陰性雙球菌，亦可有單個陰性球菌。平 皿分離培養(yǎng)顯現(xiàn)光滑、濕潤、灰白色的菌落、菌苔易取下，在生 理鹽水中呈均勻混懸液。1.2.2 生化反應接種葡萄糖、乳糖

2、、麥芽糖、甘露醇、果糖及蔗糖，于35 37C培養(yǎng)57日，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。123血清學特性將在3537C培養(yǎng)1620小時的菌苔，混懸于 0.5% ( ml /ml )甲醛生理鹽水中，或 56C加熱30分鐘殺菌后，使每 ml含 菌10億20億，與同群血清做定量凝集反應，放置3537C過夜，次日再放置室溫2小時觀察結果，以肉眼可見清晰凝集現(xiàn)象 之血清最高稀釋度(+)為凝集反應效價，必須達到原血清效價 之半。1.3 菌種保存1.3.1 菌種應凍干保存。凍干后抽樣按上述各項要求進行 檢查，合格后可作為種子批菌種用于生產(chǎn)。1.3.2 種子批菌種可低溫保存或置 28C冰箱中，生產(chǎn)前 應檢查菌

3、種的全部特性，合格后方可用于生產(chǎn)。2制造2.1 菌種將生產(chǎn)用種子批菌種啟開后，接種在 10%羊血瓊脂或其他適 宜培養(yǎng)基上，放3537C二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)一般不超過 18小時， 第24代菌種可用適宜的固體或液體培養(yǎng)基， 3537C固體培 養(yǎng)基培養(yǎng)不超過18小時，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不超過12小時。菌種 自啟開后最多不能超過5代。2.2 培養(yǎng)基生產(chǎn)多糖菌苗可選用適宜培養(yǎng)基。生產(chǎn)用的液體培養(yǎng)基不應 含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。培養(yǎng)基中不應含有對人體有害或其他過敏物質(zhì)。2.3 培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進行純菌 試驗，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應廢棄。培

4、養(yǎng) 物于對數(shù)生長期后或靜止期前期收獲。一般培養(yǎng)68小時(隨菌種接種量及使用培養(yǎng)基種類的不同而異)為宜。2.4 殺菌培養(yǎng)物加入甲醛溶液殺菌，或加熱56C 10分鐘，以確保殺菌完全及不損傷流腦多糖為宜。2.5 去核酸殺菌完成后，離心去菌體收集上清液，于其中加入十六烷基 三甲溴化銨，充分混勻形成沉淀。放置適當時間離心，收集沉淀 物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，使其最終濃度為1mol/L，搖動或攪拌1小時，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25% ( ml/ml )。冷庫靜置13小時或過夜，離心去 沉淀，收集澄清的上清液。2.6 沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80(ml

5、/ml ),充分振搖。使多糖沉淀，離心收集沉淀多糖，然后用無水乙醇及 兩酮各洗二次以上，將沉淀物(多糖粗制品)保存在-20C以下待進一步提取。2.7 多糖的精制將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達1020mg/ml，然后按1 ：2容量用冷酚(100g結晶酚溶于40ml1 : 10飽和醋酸鈉溶液)提取 23次，提取時充分振搖。 然后離心收集上清液，并用 0.1mol/L氯化鈣溶液或適宜的溶液 透析。必要或有條件時也可用其他方法去除內(nèi)毒素活性。再加乙醇至最終濃度為75%80% (ml /ml )。離心收集沉淀物用無水 乙醇及丙酮各洗二次以上。 離心后傾去上清液，用無熱原蒸餾水 溶

6、解沉淀的多糖，所得溶液即為提取之多糖，經(jīng)除菌過濾后，取 樣進行無菌試驗、血清學試驗及各項生化測定。提取過程應盡量 在15C以下進行。提純多糖應保存在 -20C或以下。3半成品檢定3.1 化學測定按生物制品化學檢定規(guī)程進行。每批多糖應測定固體總量，計算干重。3.1.1 蛋白質(zhì)含量每批提純多糖抗原的蛋白質(zhì)含量（按重量）應小于10mg/g。按Lowry法，用牛血清白蛋白作對照。3.1.2 核酸含量每批提純多糖的核酸含量（按重量）應小于 10mg/g。按分 光光度法，核酸在 260nm處的吸收系數(shù)（E1%1cm為200。3.1.3 O-乙酰基含量測定每批提純多糖的O-乙酰基含量應2mmol/g。按He

7、strin法 測定。3.1.4 磷含量每批提純多糖的磷含量應80mg/g。用鉬酸胺法測定。3.2 分子大小測定每批提純多糖的分子大小應用瓊脂糖 -4B或CL-4B凝膠過濾 法測定。Kd值應w 0.40。kd值在0.5以前的洗脫液多糖回收應 在65%以上。3.3血清學特異性試驗每批提純多糖應用血凝抑制試驗（或其他適宜方法）進行血 清學特異性試驗。A群半成品多糖抗原在抗 A群腦膜炎球菌抗體 存在下，應特異抑制 A群腦膜炎抗原致敏的紅血球凝集。3.4 提純多糖的蛋白、核酸及脂多糖含量若達不到要求可 進行再處理。4提純多糖稀釋可用單批或多批多糖合并，然后加入無菌乳糖和無菌蒸餾水（無熱原）稀釋，使每人份

8、菌苗含多糖30卩g,乳糖2.53.0mg。 乳糖規(guī)格應為分析純結晶體。5分裝與干燥分裝及容器的要求同生物制品分裝規(guī)程。6成品檢定6.1 鑒別試驗每批分裝菌苗至少取一瓶進行鑒別試驗，按3.3項方法進6.2 多糖濃度每批菌苗應檢查多糖含量，每人份多糖應不少于30卩g。磷含量應在2.25卩g以上。6.3 無菌試驗每批菌苗應按生物制品無菌試驗規(guī)程進行。6.4 安全試驗6.4.1 熱原質(zhì)試驗每批菌苗應按生物制品熱原質(zhì)試驗規(guī)程進行，家兔注射 劑量為0.025卩g/kg。判定標準按該規(guī)程4.2項要求進行。6.4.2 毒性試驗6.4.2.1 豚鼠毒性試驗至少用5只體重350400g的豚鼠，每只腹腔注射 500卩g 多糖（1ml）,觀察7天，不應引起明顯癥狀或死亡。6.4.2.2 小白鼠毒性試驗至少用5只體重1820g的小白鼠，每只腹腔注射100卩g 多糖（0.5ml ），觀察7天，不應引起明顯癥狀或死亡。6.5 分子大小測定分裝的菌苗至少5批抽一批測多糖分子大小，用瓊脂糖 -4B 或CL-4B凝膠過濾法測定，kd值應w 0.40。kd值在0.5以前的 洗脫液多糖回收率應在 65%以上。6.6 水分測定每批菌苗應測水分（費休氏法），其含量應不超過3%7菌苗稀釋液檢定稀釋菌苗用的pH6.87.2緩沖生理鹽水應經(jīng)過下列檢定。7.1 無菌試驗每批稀釋液應按生物制品