1、姓名：王方 學(xué)號：2011021816 專業(yè)：應(yīng)用化學(xué)運用具有記憶效應(yīng)的色譜柱組成模擬移動床分離氨基酸對映體Markus Fuereder, Sven Panke, Matthias Bechtold摘要替考拉寧苷元手性柱在有水作為流動相的條件下能分離氨基酸對映體，加水時考慮到了氨基酸的水溶性。因此這種固定相可以作為需要大量進樣的制備規(guī)模的手性分離提供一個選擇。然而，在現(xiàn)實的SMB系統(tǒng)中，當(dāng)注入大量的氨基酸溶液后，柱子的記憶效應(yīng)是一個需要進一步考量的因素。將注入大量的氨基酸溶液前后的色譜柱的保留時間進行對比可以看出，大量的樣品溶液可以活化色譜柱，提高樣品的保留時間。這種記憶效應(yīng)可以通過大量的不

2、含溶質(zhì)的流動相沖洗色譜柱來消除。明顯地，在設(shè)計SMB系統(tǒng)的操作參數(shù)時，繪制吸附等溫線時必須考慮到這種記憶效應(yīng)。在這篇文章中，我們運用一種微擾法來描述SMB系統(tǒng)中固定相的這種現(xiàn)象。根據(jù)由此畫出的吸附等溫線確定了SMB的操作條件，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)模型計算出的純度與實驗得到的純度吻合較好，證明這種吸附等溫線可以很精確的描述SMB系統(tǒng)的運行特點。連續(xù)三天的SMB操作得到了較為穩(wěn)定的產(chǎn)品純度（除了由于溫度的改變導(dǎo)致的純度波動外）證明在活化狀態(tài)下的吸附行為是不隨時間而改變的，用這些柱子組成模擬移動床進行長期穩(wěn)定的SMB操作在理論上是可行的。1， 簡介在過去的幾十年中，模擬移動床在精細化學(xué)和藥物化學(xué)手性分離方面

3、已得到廣泛的應(yīng)用。具有更高手性選擇性的固定相已經(jīng)商品化，大量的壽星化合物運用SMB系統(tǒng)成功分離。多虧有了更加有效的理論工具如三角形理論、計算機控制的過程模型的發(fā)展，才能更加直接的通過吸附等溫線設(shè)計SMB的操作條件。在精細化學(xué)中，運用系統(tǒng)分離外消旋氨基酸是非常重要的一環(huán)，由于氨基酸不溶于正相流動相，所以對手性固定相的選擇提出了一些挑戰(zhàn)，而且流動相中必須含有大量的水。在這篇文章中，大患糖肽手性固定相，尤其是替考拉寧和替考拉寧苷元作為手性選擇劑，有大量的氨基酸得到有效分離的例子，因此其是一種非常誘人的分離氨基酸的手性固定相。以前我們詳細調(diào)查了這種替考拉寧苷元手性固定相是否適合于SMB系統(tǒng)手性分離。我

4、們發(fā)現(xiàn)TAG柱顯示出記憶效應(yīng)，說明了色譜柱的吸附行為依賴于柱子過去的載樣量。簡單地說，就是色譜柱用大量的樣品溶液過載前后的保留時間是不同的。在所有分離的氨基酸以及所有分離條件下，都觀察到這種現(xiàn)象。尤其是在分離甲硫氨酸時，后出峰組分的保留時間的偏移可以達到25%。有趣的是，在過載之后的色譜柱選擇性比過載前要好，證明用大量的溶質(zhì)沖洗色譜柱可以活化固定相。當(dāng)用大量的不含溶質(zhì)的流動相沖洗色譜柱后，它的吸附行為緩慢回到初始狀態(tài)，因此這種記憶效應(yīng)是可逆的。然后，大量的氨基酸在SMB系統(tǒng)循環(huán)的吸附脫附證實在這種SMB操作在理論上是可行的。然而，當(dāng)設(shè)計用TAG柱分離氨基酸的SMB系統(tǒng)時，由于在過載和再生情況下

5、色譜柱的區(qū)別很大，因此必須考慮記憶效應(yīng)。如圖1所示。有記憶效應(yīng)的色譜柱偶爾有過報道，尤其在多糖手性柱中，在這種情況下，吸附行為的改變是由于流動相的改變引起，而不是由溶質(zhì)引起，這為SMB的設(shè)計提供了更加全面的考慮。這篇文章的目的是（）尋找一個合適的吸附等溫線的方法，能夠描述這種具有記憶效應(yīng)的SMB系統(tǒng)（）證實用這種具有記憶效應(yīng)的色譜柱組成SMB系統(tǒng)是可以長期穩(wěn)定操作的。圖1 （a）嚴重過載情形下的流出曲線 （b）用40ug/L的甲硫氨酸平衡前后流出曲線2， 理論2.1 微擾法在競爭吸附等溫線的繪制中，尤其是對映體手性分離中，微擾法是一種非常好的方法。簡單的來說，它是基于確定組成的溶質(zhì)溶液形成平臺

6、，然后通過少量的溶質(zhì)溶液對這種平臺進行擾動，在不同的溶質(zhì)濃度和流動相濃度下，在流出曲線上會產(chǎn)生一些正的峰或負的峰。在對映體洗脫時，在流出曲線上會形成兩個峰，通過保留時間以及下式（1）中的兩個根，可以推斷出吸附等溫線中的吸附參數(shù)。其中C1和C2分別為對映體在流動相中的濃度，q1和q2為對映體在固定相中的濃度。 （1）求出公式（1）的兩個根后，帶入公式（2）中， （2）微擾法中各組分的保留時間可以通過下面的公式用柱子的死時間表示， （3）然后，在已知吸附等溫線類型的情況下，相應(yīng)的吸附參數(shù)可以通過上述式子推斷出來。在這種情況下，我們采用雙吸附競爭型吸附等溫線，吸附為點和有相同的吸附容量。 （4）2.

7、2 SMB用三角形理論選擇SMB系統(tǒng)的操作點，全分離區(qū)域是二帶三帶流速，的函數(shù)。J區(qū)的流量可以通過算出來，切換時間，床層空隙率，柱的體積V和額外柱體積 （5）如果想要了解圖的細節(jié)和三角形理論，請參考Mazzotti的工作。為了快速確定可分離區(qū)域，可以使用簡捷算法。單次的SMB運行可以用文獻【21】描述的具體的SMB模型。這個具體的SMB模型考慮到了（）濃度曲線隨時間的動態(tài)發(fā)展（）每一種對映體的具體的動力學(xué)數(shù)據(jù)（）在SMB系統(tǒng)中具體的柱的構(gòu)象。3， 實驗3.1 化學(xué)試劑除了特別標明，甲硫氨酸，醋酸銨和其他試劑都來自Roth公司（瑞士）或者是Sigma-Aldrich公司（瑞士）。乙腈來自Chem

8、ie Brunschwig（瑞士）。所有的有機溶劑都是色譜級的。去離子水是用一臺TKA-Genpure機器制的的。3.2 色譜柱我們用一根（100mm×4.6mm,ID），粒徑為5um的色譜柱用于分析。五根制備柱（100mm×10mm，ID）用的是16um的粒徑床層。這些色譜柱都來自Sigma-Aldrich公司（瑞士）。制備柱在使用之前都已經(jīng)被不同程度的使用過。3.3 分析所有分析實驗包括吸附等溫線的繪制都是在22度時在一臺使用二極管陣列檢測器的安捷倫1100高效液相色譜儀上進行的。使用含重氫的水合折光檢測器來測定柱子的死時間。定量測定L-甲硫氨酸和D-甲硫氨酸使用的分析

9、方法是90/10%(v/v)50nmol醋酸銨pH=6.0/甲醇作為流動相，流速1.5ml/min。3.4 微擾法微擾法的步驟是用已知濃度的樣品溶液來逐步飽和色譜柱，然后進行微擾實驗。微擾實驗是通過注入10uL的與平臺濃度不同的樣品溶液完成。分別記錄0-12g/L的對映體溶液的15個濃度平臺的微擾保留時間。在這篇文章中用到不同的濃度平臺組合。其中“中間平臺法”是（單位為g/L的對映體甲硫氨酸）：0/8/2/8/1.6/8/1.2/8/0.8/8/0.4/8/0.2/8/0.16/8/0.12/8/0.08/8/0.04/8/0.02/8/0/8/4/8/12/8/0；“無中間平臺法”：0/2/

10、1.6/1.2/0.8/0.4/0.2/0.16/0.12/0.08/0.04/0.02/0/8/4/12/0；“從低到高法”：0/0.02/0.04/0.08/0.12/0.16/0.2/0.4/0.8/1.2/1.6/2/4/8/12/0；“從高到低法”：12/8/4/2/1.6/1.2/0.8/0.4/0.2/0.16/0.12/0.08/0.04/0.02/0。補充材料里有一個圖解說明和一個關(guān)于濃度平臺的表格。在進行微擾實驗之前，每個色譜柱都用50/50(v/v)的50mmol醋酸銨/乙腈用4ml/min的流速活化30min。然后用90/10(v/v)50mmol醋酸銨/甲醇沖15mi

11、n。3.5 SMB系統(tǒng)的建立和實驗SMB系統(tǒng)是基于一個改裝的AKTA基本系統(tǒng)，有兩臺P-900泵單元，五個多通閥，一個紫外/可見檢測器組成。一個泵單元用來提供進料和流動相，另一個泵用來提取液和提余液的流速。每一個泵都與一個多通閥連接。第五個多通閥將提取液從四帶中導(dǎo)出來。每兩個柱子之間都有一個止回閥都是用來正確引導(dǎo)流動相的流向的。SMB系統(tǒng)是由相同的單元組成的，每個單元如圖2所示。圖2 系統(tǒng)單個柱系統(tǒng)的構(gòu)造系統(tǒng)每個部分的額外的柱體積由每個區(qū)的柱數(shù)決定，一個柱的額外柱體積為0.1mL。提余液的濃度用235nm的紫外光檢測。一旦達到平衡狀態(tài)，提取液和提余液的純度就可以測量了。到達平衡狀態(tài)的時間通過具

12、體的SMB模擬來進一步確認。每個樣品都收集兩個循環(huán)的量，然后用HPLC進行定量分析。流出速率通過收集另外一段時間的流體然后稱量計算得到。進入系統(tǒng)的料液在輸送進去之前都要經(jīng)過脫氣處理。另外，在進入SMB系統(tǒng)前，所有料液還要經(jīng)過一個在線脫氣裝置。我們用一個改進版本的UNICORN軟件來控制泵系統(tǒng)，多通閥系統(tǒng)和檢測器系統(tǒng)。在SMB系統(tǒng)運行之前，這個系統(tǒng)用50/50(v/v)的50mmol醋酸銨/乙腈用4ml/min的流速活化30min。SMB系統(tǒng)的運行用兩個流動相組成方案：90/10和75/25(v/v)50mmol醋酸銨/甲醇組成。每種方案下，進料為10g/L的外消旋甲硫氨酸溶解于相應(yīng)的流動相中。

13、所有的SMB操作都在1-2-1-1的柱分布系統(tǒng)下進行。3.6 模擬和擬合步驟為了通過微擾法獲得吸附等溫線，我們運用了基于模型的實驗方法。通過優(yōu)化演算法來縮小實驗與模型的數(shù)據(jù)的差距，來獲得實驗參數(shù)。這個優(yōu)化過程通過MATLAB軟件來完成，通過優(yōu)化方程“fminsearch”來確定有最小偏差的參數(shù)。這些SMB模型在MATLAB上實行。4， 結(jié)果和討論當(dāng)SMB系統(tǒng)中運用具有由溶質(zhì)引起的記憶效應(yīng)的柱子時，可以做兩個假設(shè)：（）在一定時間的操作之后，吸附行為的發(fā)展仍然沒有大的變化（）可以用一個合適的吸附等溫線來描述這種SMB的穩(wěn)定狀態(tài)。我們首先假設(shè)第二點成立，然后我們可以在此基礎(chǔ)上在一個比較合適的操作點確

14、認第一點的正確性。4.1 方法的發(fā)展只有考慮到熱力學(xué)和動力學(xué)的對色譜過程的精確描述，才能比較好的設(shè)計SMB的模型和操作條件。當(dāng)質(zhì)量轉(zhuǎn)移比較慢時，會引起流出濃度曲線的展寬，進而會影響分離情況。原則上，記憶效應(yīng)引起的保留時間偏移可以認為是吸附等溫線和質(zhì)量轉(zhuǎn)移動力學(xué)的共同作用的結(jié)果。然而，有一些推論證明后者沒有改變多少。首先，保留時間的偏移并不能用質(zhì)量轉(zhuǎn)移動力學(xué)做一個合理的解釋，因此可以推斷出吸附等溫線是是記憶效應(yīng)的主要來源。其次，最初的濃度流出曲線與再生后柱子的流出曲線差異很小，顯示出質(zhì)量轉(zhuǎn)移動力學(xué)并沒有發(fā)生大的改變。根據(jù)再生柱子的濃度曲線做出范第姆特曲線也進一步證明了之前的操作是非常正確的。在如

15、此高的塔板數(shù)的情況下，在SMB系統(tǒng)中的質(zhì)量轉(zhuǎn)移阻力適中，然后SMB的運行對質(zhì)量轉(zhuǎn)移的輕微變化并不敏感。然后，就可以假設(shè)，從再生的柱子獲得的質(zhì)量轉(zhuǎn)移動力學(xué)對活化狀態(tài)的柱子的描述也是很精確的。4.1.1 繪制吸附等溫線的方法的選擇吸附等溫線有一系列不同的繪制方法，每一個都有各自的優(yōu)點和缺點。當(dāng)存在這個特殊的具有記憶效應(yīng)的柱子時，需要研究固定相的性質(zhì)，這樣才能在繪制吸附等溫線之前確定類似SMB的狀態(tài)。這就限制了對那些基于濃度平臺的測定方法的選擇，比如說微擾法，逆方法，前沿分析法。當(dāng)多組分的流出曲線需要把每個組分的貢獻都計算出來時，前沿分析法在實驗時是比較昂貴的，流出曲線中的成分還需要額外的HPLC分

16、析。逆方法包括直接來自逆方法的帶有一些信息的曲線方法和來源于HPLC流出曲線的逆方法。由于介紹過的逆方法獲得的實驗信息量大于一般的逆方法，因此可以用更少的實驗來獲得。另一方面，這種曲線分析方法在數(shù)量上是比較貴的。在我們的研究中，我們選擇微擾法，它不需要額外的HPLC分析，可以快速從實驗數(shù)據(jù)算出吸附等溫線。而且，不需要校正檢測器，純對映體的消耗比較少，因此需要消耗更多的外消旋體，但是由于本來消耗對映體的量就不多，因此這對我們是可以接受的。4.1.2 在微擾法中的記憶效應(yīng)在沒有記憶效應(yīng)的SMB系統(tǒng)中，濃度平臺的不同組合，不同的濃度安排順序，希望不會對溶質(zhì)的保留時間產(chǎn)生影響。相反地，在具有記憶效應(yīng)的

17、柱子上的保留時間極度依賴于柱子的以往使用的歷史。SMB系統(tǒng)可以通過大量溶質(zhì)的循環(huán)吸附和脫附來描述。由于溶質(zhì)會活化柱子，所以必須保證這種狀況在已定的吸附等溫線模型之中。但是比較有爭議的是，隨著SMB的模擬程度的增加，估計步驟的精度也應(yīng)該跟著增加。然而，準確的SMB的濃度流出曲線只有在吸附等溫線和操作點知道時才能進行估計，但是吸附等溫線和操作點在此時顯然是不知道的。然后，我們引入了一個額外的濃度平臺來建立微擾法的濃度平臺的大小和順序，用來近似模擬SMB的實際情況。具體情況是，我們選擇一個濃度平臺8g/L作為這個額外的濃度平臺，平臺時間是10min，這對SMB的實際情況是比較符合的，其中當(dāng)SMB中進

18、料濃度是25g/L（溶解度限）時，其中流動相組成是90/10的50mM NH4Ac pH6.0/Methanol。4.2 重現(xiàn)性和柱子的異質(zhì)性在評價繪制吸附等溫線的方法是否有用前，必須對柱子的重現(xiàn)性和異質(zhì)性進行考察。由實驗步驟和柱子異質(zhì)性引起的誤差引入到SMB系統(tǒng)中，成為了誤差的來源，除此之外，這個描述記憶效應(yīng)的方法存在潛在的缺點。4.2.1 重現(xiàn)性為了調(diào)查這種這種方法的魯棒性和連續(xù)生產(chǎn)的重現(xiàn)性，在相同的狀態(tài)下用同一根柱子分三次運行。先流出組分的保留時間的平均值是5.2min，相對標準誤差為0.2%，后流出組分的保留時間的平均值是7min，相對標準誤差是0.38%。微擾法保留時間的相對誤差相對

19、于記憶效應(yīng)引起的偏差來說小得多。這也表明在負載情況下的吸附行為是可以重現(xiàn)的。除此之外，現(xiàn)有模型的實驗誤差是相當(dāng)小的。4.2.2 柱子的異質(zhì)性柱子的異質(zhì)性是SMB操作的精確預(yù)言的一個重要部分。通常只用一根柱子的熱力學(xué)參數(shù)來模擬SMB。Mihlbachler等證實隨著柱子的異質(zhì)性的增加，可分離區(qū)域是減少的。當(dāng)吸附行為發(fā)生在非線性區(qū)域時，這種現(xiàn)象尤為明顯。因為這個SMB系統(tǒng)中運用的柱子在使用前都被不同程度的用過，所以我們這些柱子的熱力學(xué)性質(zhì)的差異。這個復(fù)雜分析的第二個目的是找到一根特定的柱子來代表所有的柱子繪制吸附等溫線。然后當(dāng)對其他狀態(tài)下的SMB的表現(xiàn)進行評價時，這個設(shè)計可以用一根柱子來繪制吸附等

20、溫線，而不需要所有的柱子。然后，我們對所有的柱子進行微擾實驗。如圖3所示：圖3 5根柱子的微擾實驗的結(jié)果這5根柱子的先流出組分的保留時間平均偏差為1.0%，后流出組分的保留時間的平均偏差為1.3%。柱子的異質(zhì)性在低濃度時表現(xiàn)得尤為明顯。當(dāng)流動相中溶質(zhì)濃度為0時，第二個峰的平均相對誤差為3.4%，當(dāng)溶質(zhì)濃度達到最高的12g/L時，即單個異構(gòu)體的濃度是6g/L時，兩個峰的相對標準偏差都只有0.8%。這5根柱子的平均死時間為3.42min，平均相對標準誤差是1.0%，然后可以算得平均空隙率是0.65。通常保留時間的區(qū)別來源于裝柱過程中固定相的裝填的不同。然而，這里的結(jié)果顯示保留時間的差異不能用裝填過

21、程中空隙率的區(qū)別來解釋。而且，我們沒有觀察到非保留組分與保留組分的保留時間之間有什么關(guān)系。這顯示柱與柱之間的波動來源于固定相本身。先前提到，這些柱子在組成SMB之前都被不同程度的用過，因此在保留時間上有一些輕微的下降。4.3 基于微擾法的SMB設(shè)計和SMB系統(tǒng)的操作4.3.1 參數(shù)推斷然后，用微擾法推斷出的保留時間可以用來繪制吸附等溫線，用來設(shè)計SMB。第一步是考察哪一種吸附等溫線可以很好的模擬這個過程。前期的在吸附機理的調(diào)查顯示替考拉寧柱分離甲硫氨酸時有兩個手性選擇位點。然后，我們成功地將一個熱力學(xué)一致的雙吸附類型Bi-Langmuir吸附等溫線運用于HPLC流出曲線的描述。在相關(guān)的抗生素的

22、柱上，這種吸附等溫線已經(jīng)被報道過很多次，在某些情況下，運用簡化的Bi-Langmuir吸附等溫線，這種等溫線有更少的吸附參數(shù)。結(jié)果，我們試過很多種不同的吸附等溫線，其中含有近似一致的Bi-Langmuir吸附等溫線（含有6個參數(shù)）和一致的Bi-Langmuir吸附等溫線，然后還有一個近似一致的具有兩個手性選擇位點的三吸附Langmuir吸附等溫線。用近似一致的模型獲得的數(shù)據(jù)與具有更高參數(shù)的模型獲得的實驗數(shù)據(jù)沒有明顯的區(qū)別，然后我們運用了近似一致的雙吸附Bi-Langmuir吸附等溫線來用這五根柱子進行微擾分析。，如圖4所示，是柱5保留時間和平均保留時間的比較。圖4 最佳模型和柱5的實驗數(shù)據(jù)的比

23、較（實線為最佳模型的數(shù)據(jù)，圓點為柱5的數(shù)據(jù)）然后，我們根據(jù)五個柱子的平均保留時間算出了平均參數(shù)（如表1所示）。獲得的參數(shù)表明，在雙吸附Bi-Langmuir吸附等溫線中的兩個吸附位點的基本不同點，一個吸附位點有高的飽和容量，小的Langmuir常數(shù)；另一個吸附位點有低的飽和容量，大的Langmuir常數(shù)。后面一個吸附位點的推測出的參數(shù)的相對偏差相對前者來說比較高，這也證實了在小濃度時的保留時間的偏差要大于大濃度時的保留時間的偏差。在低濃度時，第二個吸附位點還沒有過載，對吸附等溫線的影響較大。值得注意的是，從推算出的吸附參數(shù)可以推斷出這兩個吸附位點都是手性選擇性吸附。然后，我們運用的吸附等溫線應(yīng)

24、該是對實際情況比較準確的一個描述，因為非手性選擇性作用在樣品的保留中是普遍存在的。表1 根據(jù)5根柱子的保留時間和平均保留時間算出的熱力學(xué)參數(shù)4.3.2 實驗和模擬的純度比較4.3.2.1 甲醇的含量為10%的情況。為了評價的設(shè)計方案的可行性，選出最具代表性的柱子來繪制吸附等溫線，通過已獲得的吸附等溫線獲得的操作程序與實際的SMB的操作結(jié)果進行比較。通過簡捷算法可以算出完全分離區(qū)的面積，然后運用到所有的柱子中。這種方法依賴于色譜的平衡理論，但是忽視了非重要因素如質(zhì)量轉(zhuǎn)移阻力的影響。然而，已經(jīng)證明對于理論塔板數(shù)大于100的系統(tǒng)來說，偏差是很小的，用簡捷算法來估算整個過程是比較準確的。為了確定一個比

25、較準確的濃度范圍，全分離區(qū)域的面積是通過平衡理論方法在不同的進料濃度條件下算出來的。在高濃度時，全分離區(qū)域的面積變得很小，超過了SMB穩(wěn)定操作的范圍。既要考慮到效率又要考慮到魯棒性，因此進料濃度確定為10g/L。由于柱子的異質(zhì)性，根據(jù)不同柱子的保留時間算出的可分離區(qū)域的位置有一些不同（如圖5所示），但是沒有很大的區(qū)別。圖5 根據(jù)不同柱子算出的吸附等溫線參數(shù)下的可分離區(qū)域這表明吸附參數(shù)的不同并不會對以后的可分離區(qū)域的推導(dǎo)產(chǎn)生很大的影響，但是確實是柱子異質(zhì)性的一個反映。基于這個可分離區(qū)域，我們選擇了不同的操作點，從提余液純萃取液不純到提余液純萃取液純到提余液不純萃取液純的區(qū)域都有。在所有的12個操

26、作情況下，四個在所有柱子的全分離區(qū)域的點得到的產(chǎn)物的純度沒有很大的區(qū)別。通常情況下，所有的操作情況下，試驗數(shù)據(jù)與簡捷算法算出的結(jié)果吻合很好。然而，從簡捷算法獲得的信息很有限，不能獲得提余液和提取液的純度。如果用一個更具體的SMB模型，這個模型考慮到了動力學(xué)的影響，實際的柱的構(gòu)象的影響，色譜柱的大小和維度的影響，就可以獲得更多更高級的信息。然而，為了操作起來更簡捷，我們將所有的柱子都用了同一個吸附等溫線。然后，我們總結(jié)了從范第姆特方程得到的非理想狀態(tài)的狀態(tài)（線性LDF模型，質(zhì)量轉(zhuǎn)移系數(shù)軸向擴散系數(shù)通過通過軸向擴散因子A計算得到，其中為流動相的線速度）。從更具體的SMB模型得到的流出物的純度與實驗

27、得到的數(shù)據(jù)吻合很好。這也證明了我們最初的假設(shè)就是質(zhì)量轉(zhuǎn)移動力學(xué)在過載狀態(tài)下并沒有發(fā)生很大的改變。4.3.2.2 甲醇的含量為25%的情況這個研究的一個目的就是發(fā)展一個快速和比較可靠的吸附等溫線的方法，來繪制代表一些柱子的一個柱子的吸附等溫線。為了找出這個最具代表性的柱子，我們（1）比較了所有的柱子的保留時間和平均保留時間（2）比較了所有柱子的熱力學(xué)參數(shù)和由平均保留時間算出的熱力學(xué)參數(shù)進行比較。兩種方法都表明柱5是最能代表所有柱子的色譜柱。這個代表性的柱子的全分離區(qū)域與由平均保留時間得到的可分離區(qū)域的比較如圖6所示：圖6 柱5與由平均保留時間算出的可分離區(qū)域的比較（實線為柱5，虛線為平均保留時間

28、算出的可分離區(qū)域）初步的試驗表明甲硫氨酸的保留時間和選擇性都會隨著流動相中甲醇含量的增加而增加。為了確認這些結(jié)果并進一步驗證目前吸附等溫線繪制方法的合理性。我們運用柱5并在含25%甲醇的流動相情況下對其進行微擾分析（結(jié)果如表3所示）。表3 柱5在含25%甲醇的流動相的微擾法下算出的吸附參數(shù)確實，當(dāng)比較含10%甲醇和25%甲醇兩種條件下的可分離區(qū)域的面積時（如圖7所示），25%情況下面積確實要大一些，這表明具有更大的產(chǎn)量和更高的魯棒性。我們在含25%甲醇情況下做了兩組實驗：一個是在可分離區(qū)域，另一個是在純提取液區(qū)域。圖7 柱5在含有10%和25%甲醇情況下的可分離區(qū)域的比較獲得的實驗純度（如表4

29、所示）與具體的SMB模型獲得的純度吻合很好，更加證實了當(dāng)前吸附等溫線繪制方法的正確性。表4 25%甲醇情況下兩個操作點的獲得數(shù)據(jù)的比較4.4 不同的平臺搭配的吸附等溫線比較就如早期討論過的一樣，不同進樣濃度的搭配可以看做是SMB模型的一種近似。有了來自吸附等溫線的數(shù)據(jù)，我們就能在能更好分離的全分離區(qū)域估算SMB的濃度曲線。這個吸附等溫線方法理論上可以更好的代表SMB的狀態(tài)，因此這個吸附等溫線方法可以提高SMB的可預(yù)測性。然而，至少在我們的操作條件下，這個預(yù)測的精度是比較準確的。另一方面，另一種比較簡單的不含中間濃度平臺的方法可能也能獲得一個好的吸附等溫線。為了檢查這種方法是否有意義，我們實施了

30、三種簡化了記錄方式的簡化方法（1）第一種記錄方案與“中間濃度平臺法”有相同的濃度平臺，但是沒有中間濃度平臺（“無中間濃度平臺法”）（2）一個階梯的從低到高的濃度方案（從低到高法）（3）一個階梯的從高到低的濃度方案（從高到低法）。我們用完全相同的初始值來估算吸附參數(shù)，然后比較了各種方法下的全分離區(qū)域和產(chǎn)物純度。從“無中間平臺法”和“從低到高法”獲得的結(jié)果非常相似（如圖8所示）。在這兩種情況下，全分離區(qū)域的面積要比“中間平臺法”獲得的全分離區(qū)域的面積小。有趣的是在“中間平臺法”下，實驗獲得的殘留物的濃度與由模型推算出的濃度是可以相比擬的（如表5所示）。圖8 由四種不同方法獲得的可分離區(qū)域，其中實線

31、：中間平臺法；點線：無中間平臺法；虛線：從高到低法；點劃線：從高到低法。然而，“中間平臺法”對提取液和提余液的濃度估計都太過樂觀（基于圖來說，就是可分離區(qū)域的面積太大）；由“從低到高法”和“無中間平臺法”對提取液的濃度估計太過樂觀，對提余液的濃度估計太過悲觀（從圖來說就是三角形區(qū)域太往下偏了）；這些結(jié)果的區(qū)別也從微擾保留時間的偏差上可以看出來。特別地，在低濃度時的保留時間上，“中間平臺法”明顯高于“從低到高法”和“無中間平臺法”，這表明記憶效應(yīng)在后兩個方法上是比較不明顯的。三角形位置的偏移可以認為是因為參數(shù)估計的不準確，全分離區(qū)域的過大估算可以認為是因為柱子的異質(zhì)性導(dǎo)致的。因此，“中間平臺法”是更合適的。表5 不同平臺搭配方法獲得的產(chǎn)品純度和實驗獲得的純度的比較我們發(fā)現(xiàn)“從低到高法”能獲得與“中間平臺法”相似的結(jié)果（如圖8所示），表明這個方法可以取代實驗上更加昂貴的“中間平臺法”。通過這種方法，柱子在開始相當(dāng)長一段時間內(nèi)會注入一些高濃度的溶質(zhì)溶液來活化柱子。其后的濃度平臺都是都是通過從高濃度解吸到低濃度來實現(xiàn)的，盡管相對于