1、qPCRqPCR系統系統“從從RNARNA提取到熒光定量提取到熒光定量PCR”PCR”解決方案解決方案生物化學與分子生物學教研室生物化學與分子生物學教研室內容概要內容概要1 熒光定量熒光定量PCR的原理的原理1 熒光定量熒光定量PCR的標記方法的標記方法1 熒光定量熒光定量PCR解析方法解析方法1 熒光定量實驗流程及注意事項熒光定量實驗流程及注意事項1 熒光定量應用及實例熒光定量應用及實例實時定量實時定量PCR技術：技術：利用利用熒光信號的變化實時檢測熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中擴增反應中每一每一個循環擴增產物量的變化個循環擴增產物量的變化，通過，通過Ct值和標準曲線的值和標準曲線的

2、關系對關系對起始模板起始模板進行定量分析進行定量分析與常規與常規 PCR技術比較：技術比較：對對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析，擴增反應的終點產物進行定量和定性分析，無法無法對起始模板準確定量對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測，無法對擴增反應實時檢測熒光定量熒光定量PCR原理原理定義定義熒光定量熒光定量PCR原理原理常用名詞概念常用名詞概念介紹三個概念：介紹三個概念： 擴增曲線、熒光閾值、擴增曲線、熒光閾值、CtCt值值如何對起始模板定量？如何對起始模板定量？通過通過CtCt值和標準曲線對值和標準曲線對起始模板起始模板進行定量進行定量分析分析Cycle（循環數）（循環數）R

3、n（熒光強度）（熒光強度）BaselineLogliner phase平臺期平臺期熒光基團熒光檢測元件熒光定量熒光定量PCR原理原理擴增曲線擴增曲線 2. 熒光定量標準曲線Cycle（循環數）（循環數）Rn（熒光強度）（熒光強度）BaselineLogliner phase1 前前15個循環信號作為熒個循環信號作為熒光本底信號（光本底信號（baseline）1真正的信號真正的信號:熒光信號熒光信號超過域值，進入指數擴增超過域值，進入指數擴增期之后期之后1熒光域值熒光域值的缺省設置是的缺省設置是315個循環的熒光信號的個循環的熒光信號的標準偏差的標準偏差的10倍倍1手動設置：大于熒光背手動設置：

4、大于熒光背景值和陰性對照的熒光最景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數期的最初高值；進入指數期的最初階段階段Threshold熒光定量熒光定量PCR原理原理熒光域值熒光域值平臺期平臺期Ct值的定義：值的定義： PCR擴增過程中，擴增過程中，擴增產物的熒光信擴增產物的熒光信號達到設定的閾值號達到設定的閾值時所經過的時所經過的擴增循擴增循環次數環次數Cycle（循環數）（循環數）Rn（熒光強度）（熒光強度）Ct value 熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值值同一個樣品重復同一個樣品重復9696次次PCRPCR的擴增曲線的擴增曲線 熒光定量熒光定量PCR原理原理PCR vs qPCRCtCt值

5、的特點：值的特點： 相同模板進行相同模板進行9696次擴增，終點處產物量不恒定；次擴增，終點處產物量不恒定； CtCt值則極具重現性值則極具重現性理想的理想的PCR反應反應XnX0 2n*Xn：第：第n次循環后擴增產物數量次循環后擴增產物數量X0 ：起始模板數量：起始模板數量n：擴增循環數：擴增循環數熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值定量的數學原理值定量的數學原理非理想的非理想的PCR反應反應XnX0 （1En）n*Xn：第：第n次循環后擴增產物數量次循環后擴增產物數量X0 ：起始模板數量：起始模板數量n：擴增循環數：擴增循環數En：擴增效率：擴增效率熒光定量熒光定量PCR原理原理CtC

6、t值定量的數學原理值定量的數學原理在擴增產物達到熒光閾值時，所經歷的循環數為在擴增產物達到熒光閾值時，所經歷的循環數為CtXCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：在閾值設定以后，：在閾值設定以后，XCt是一個常數，可以用熒光強度表示的產物量，定為是一個常數，可以用熒光強度表示的產物量，定為M方程式（方程式（1）兩邊同取對數得：）兩邊同取對數得：LogMLogX0 *（1En）Ct （2）整理方程式（整理方程式（2）：）：LogX0 Log M Ct Log（1En）熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值定量的數學原理值定量的數學原理Cycle numberCk 104Ck 102Sa

7、mpleLog of DNA concentration0 起始模板量越多，熒起始模板量越多，熒光達到域值的循環數越少，光達到域值的循環數越少，即即Ct值越小。值越小。0 Log模板起始濃度與模板起始濃度與Ct值呈線性關系。值呈線性關系。熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值與模板起始量的關系值與模板起始量的關系q確定未知樣品的確定未知樣品的 C(t)C(t)值值 q通過標準曲線由未知樣品的通過標準曲線由未知樣品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample25線性關系、擴增效率確認線性關系、擴增效率確認檢測靈敏度確認檢測靈敏度確認標準曲線斜率標準曲線斜率: -3 : -3

8、-3.5-3.535Cycles35Cycles內可得到好的定量結果（科研領域）內可得到好的定量結果（科研領域）如果采用如果采用SYBRSYBR檢測方法，檢測方法，30Cycles30Cycles內無非特異性產物擴增內無非特異性產物擴增35 Cycles35 Cycles內無引物二聚體產生內無引物二聚體產生相關系數（相關系數（R R2 2）：大于）：大于0.980.98熒光定量熒光定量PCR反應有效性的確認反應有效性的確認PCRPCR擴增效率（擴增效率（E E）:0.9-1.2:0.9-1.2. 定性分析研究：定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等）分析等. 絕

9、對定量研究：絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數定量，病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數定量， GMO定量檢測等定量檢測等. 相對定量研究：相對定量研究：mRNA表達量分析，表達量分析，siRNA效果確認，基因芯效果確認，基因芯 片結果驗證，差異顯示結果驗證等片結果驗證，差異顯示結果驗證等熒光定量熒光定量PCR技術的應用技術的應用內容概要內容概要1 熒光定量熒光定量PCR的原理的原理1 熒光定量熒光定量PCR的標記方法的標記方法1 熒光定量熒光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項1 TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南公司熒光定量產品選擇

10、指南非特異性熒光標記非特異性熒光標記 SYBR Green I特異性熒光標記特異性熒光標記 TaqMan Probe分子信標分子信標常用熒光標記方法常用熒光標記方法SYBR Green I染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一種結合于所有是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。區域的具有綠色激發波長的染料。SYBR Green I熱熱 變變 性性引物退火引物退火延伸反應延伸反應SYBR Green I 染料法染料法作用機理作用機理q SYBR Green SYBR Green 能結合到雙鏈能結合到雙鏈DNADNA的小溝部位的小溝部位q SYBR

11、Green 只有和雙鏈只有和雙鏈DNA結合后才發熒光結合后才發熒光q 變性時，變性時，DNA雙鏈分開，無熒光雙鏈分開，無熒光q 復性和延伸時，形成雙鏈復性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發熒光，在此階段發熒光，在此階段 采集熒光信號。采集熒光信號。SYBR SYBR GreenGreen SYBR Green I 染料法染料法作用機理作用機理Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板模板DNA量越多，熒光量越多，熒光達到域

12、值的循環數越少達到域值的循環數越少q Log濃度與循環數呈線性濃度與循環數呈線性關系，根據樣品關系，根據樣品Ct值，就可值，就可以計算出樣品中所含的模板以計算出樣品中所含的模板量量實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲線分析熔解曲線分析溫度溫度熒光強度熒光強度TmTm值：值：DNA解鏈一半時的溫度解鏈一半時的溫度實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲線分析熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導。將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)-dIdTTmSingle

13、 amplified product溶解曲線檢測引物特異性溶解曲線檢測引物特異性 Melt curve showing two amplified products SYBR Green SYBR Green 法法 -PCR-PCR反應的建立反應的建立反應體系的建立及優化反應體系的建立及優化:SYBR Green 使用濃度使用濃度:太高抑制太高抑制Taq酶活性，太低，酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準量不準MgCl2的濃度的濃度:可以降低到可以降低到1.5mM,以減少非特異性以減少

14、非特異性產物產物反應反應Buffer 體系的優化體系的優化反應溫度和時間參數反應溫度和時間參數:由酶和引物決定由酶和引物決定1. 其他與常規其他與常規PCR相同相同SYBR Green SYBR Green 法法 應用范圍應用范圍q 起始模板的測定起始模板的測定q 融解曲線分析：可以優化融解曲線分析：可以優化PCR反應的條件，對常規反應的條件，對常規PCR有指導意義，如對有指導意義，如對primer的評價；可以區分單一的評價；可以區分單一引物、引物二聚體、變異產物、多種產物。引物、引物二聚體、變異產物、多種產物。SYBR Green SYBR Green 法法 優缺點優缺點 q 對對DNA模板

15、沒有選擇性模板沒有選擇性 -適用于任何適用于任何DNAq 使用方便使用方便 -不必設計復雜探針不必設計復雜探針q 非常靈敏非常靈敏q 便宜便宜優 點q 容易與非特異性雙鏈容易與非特異性雙鏈DNA結合，產生假陽性結合，產生假陽性 但可以通過但可以通過融解曲線的融解曲線的分析分析，優化反應條件，優化反應條件q 對引物特異性要求較高對引物特異性要求較高缺 點問題點：問題點： SYBR Green I與任何雙鏈與任何雙鏈DNA進行結合后散發熒光，因進行結合后散發熒光，因此如果反應體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產生，也將此如果反應體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產生，也將同時被檢測，從而可能導致檢

16、測結果不準確。同時被檢測，從而可能導致檢測結果不準確。SYBR Green I染料法染料法問題點與關鍵點問題點與關鍵點關鍵點：關鍵點： 設計合適引物，防止非特異性擴增！設計合適引物，防止非特異性擴增！Taqman探針法探針法原理原理+ 5端標記有報告基團端標記有報告基團(Reporter, R)+ 3端標記有熒光淬滅基團端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q)+ 探針完整，探針完整，R發射的熒光能量被發射的熒光能量被Q基團吸收基團吸收 ，無熒光，無熒光， R與與Q分開，發熒光分開，發熒光+ Taq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針法探針法

17、工作機理工作機理熱變性熱變性引物和探針與模板退火引物和探針與模板退火延伸反應延伸反應每擴增一條每擴增一條DNA分子，釋分子，釋放一個熒光信放一個熒光信號，可以在循號，可以在循環過程中任一環過程中任一點檢測熒光點檢測熒光1、引物、探針的設計原則：、引物、探針的設計原則： 探針探針Tm為為68-70 ，30 bp, 5不能有不能有G，G可能會淬滅熒光可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段素，引物盡量靠近探針，擴增片段200 bp，引物，引物Tm為為59-60 2、反應參數的設定：、反應參數的設定： 一般為：一般為：94 ，10-20S 60， 30-60S（Taq酶酶53外切核酸酶活性在外切

18、核酸酶活性在60 最高），也可通過溫度梯度優化退火溫度最高），也可通過溫度梯度優化退火溫度 3、優化引物和探針濃度：獲得最小、優化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號值，最大信號/背景比值背景比值 引物濃度：引物濃度：100-900nM 探針濃度：探針濃度：50-300nM4、其他與常規、其他與常規PCR相同相同Taqman探針法探針法PCR體系的建立體系的建立TaqManTaqMan法法 優缺點優缺點q 對目標序列的高特異性對目標序列的高特異性 -陰性結果確定陰性結果確定q 設計相對簡單設計相對簡單 -與目標序列某一區與目標序列某一區域互補域互補q 重復性比較好重復性比較好優優 點點q

19、只適合一個特定的目標只適合一個特定的目標q 委托公司標記，價格較高委托公司標記，價格較高q 不易找到本底低的探針不易找到本底低的探針缺缺 點點實時熒光定量實時熒光定量PCR的分類的分類幾種方法的比較幾種方法的比較方方 法法優點優點缺缺 點點適適 用用 范范 圍圍SYBR Green I 方法方法適用性廣適用性廣靈敏靈敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出現非特異性帶易出現非特異性帶適合科研中對各種目的基適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植的研究，轉基因重組動植物的研究物的研究TaqMan 方法方法特異性高特異性高重復性好重復性好價格高價格

20、高只適合特定目標只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基病原體檢測，疾病耐藥基因研究因研究,藥物療效考核藥物療效考核,遺遺傳疾病的診斷傳疾病的診斷Molecular beacon 法法(分子信標分子信標)原理原理標記熒光的發夾探針標記熒光的發夾探針 環與目標序列互補環與目標序列互補莖由互補配對序列組成莖由互補配對序列組成環莖熒光素 淬滅劑發夾型雜交探針發夾型雜交探針Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標分子信標) ) 工作原理工作原理q 熒光共振能量轉移（熒光共振能量轉移（FRET）q 探針與探針與DNA雜交時產生熒光雜交時產生熒光 -變性過程：產生非特異

21、性熒光變性過程：產生非特異性熒光 -延伸過程：不產生熒光延伸過程：不產生熒光 -退火過程：產生特異性熒光，檢測熒光信號退火過程：產生特異性熒光，檢測熒光信號Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標分子信標) ) 應用范圍應用范圍 q 起始模板的定量起始模板的定量q 基因型分析基因型分析q 產物鑒定產物鑒定q SNP（單核苷酸多態性）分析（單核苷酸多態性）分析Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標分子信標) ) 優缺點優缺點q高特異性：對目標序列高特異性：對目標序列 檢測檢測SNP最靈敏的試劑最靈敏的試劑 之一之一

22、q熒光背景低熒光背景低優優 點點q 只能用于一個特定目標只能用于一個特定目標q 設計困難設計困難q 價格比較高價格比較高缺缺 點點內容概要內容概要1 熒光定量熒光定量PCR原理原理1 熒光定量熒光定量PCR的標記方法的標記方法1 熒光定量熒光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項1 TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南公司熒光定量產品選擇指南熒光定量熒光定量PCR的解析方法的解析方法（依據課題要求提前確定）（依據課題要求提前確定） 絕對定量解析方法絕對定量解析方法 相對定量解析方法相對定量解析方法 絕對定量解析方法絕對定量解析方法Sample25絕

23、對定量的定義絕對定量的定義0 Log（起始濃度）與循環數呈線性關系，通過已知起（起始濃度）與循環數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品始拷貝數的標準品,可作出可作出標準曲線標準曲線,即得到該擴增反應即得到該擴增反應存在的線性關系存在的線性關系0 根據樣品根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量值，就可以計算出樣品中所含的模板量質粒標準品的制備質粒標準品的制備PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆質粒提取，質粒提取，ODOD值定量，將質粒梯度稀釋作為標準品使用值定量，將質粒梯度稀釋作為標準品使用質粒質粒基因組基因組DNADNA拷貝數的計算：拷貝數的計算：待測樣本濃度（待測樣本濃度（ng/u

24、l）OD26050稀釋倍數稀釋倍數樣本分子量樣本分子量=堿基數堿基數324待測樣本拷貝數（待測樣本拷貝數（copies/ul）=待測樣本濃度待測樣本濃度/樣本分子量樣本分子量61014 倍比梯度稀釋方法：倍比梯度稀釋方法：1v原液原液(標準品標準品i) +9v稀釋緩沖液，得標準品稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品標準品iii +9v稀釋緩沖液，得標準品稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品標準品iv +9v稀釋緩沖液，得標準品稀釋緩沖液，得標準品v質粒標準品稀釋方法與拷貝數計算質粒標準品稀釋方法與拷貝數計算實時熒光定量實時熒光

25、定量PCRPCR法絕對定量方法法絕對定量方法q 方方 法：法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測q 試試 劑：劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）q 標準品：標準品：質粒標準品濃度為106、105 、104 、 103 ；2個重復；設陰性空白對照q 實驗步驟：實驗步驟：提取HBV DNA； 設計特異引物； 設計TaqMan探針并標記探針； 熒光定量擴增； 結果分析：獲取血液樣品中HBV DNA的精確copy數。絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的絕對定量的絕對定量SampleS

26、amplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD標準品510328.1828.6428.410.16標準品510425.2525.1425.190.04標準品510522.1122.4622.280.12標準品510618.6318.9218.770.10未知樣品? ?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數據實驗數據絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的絕對定量的絕對定量擴增效率（擴增效率（E）計算）計算 E = 10-1/斜率 1 = 10-1/-3.29 1 = 2.0

27、11 = 1.01 標準曲線制作：標準曲線制作：利用利用Mean Ct 作圖可得到標準曲線作圖可得到標準曲線y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的絕對定量的絕對定量相關系數（相關系數（R R2 2）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近1 1，結果可信度越高。，結果可信度越高。 擴增效率（擴增效率（E E）：）：0.9-1.2, 0.9-1.2, 越接近越接近1 1，越理想。，越理想。未知樣品拷貝數的計算未知樣品拷貝數的計算將Ct值帶入線性方程：20.5= -3.29 X + 40.33Quan

28、tityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies 絕對定量實驗例絕對定量實驗例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的絕對定量的絕對定量X=20.5-40.33-3.29=6.03 相對定量解析方法相對定量解析方法實際目的基因表達量分析實際目的基因表達量分析相對定量的必要性相對定量的必要性必須用內對照基因必須用內對照基因（管家基因）（管家基因）進行校進行校正，進行相對表達量分析。正，進行相對表達量分析。管家基因管家基因 維持細胞基本代謝活動所必須的基因維持細胞基本代謝活動所必須的基因, , 如：如：GAPDHGAPDH、ActinActin、18S rRNA18S

29、rRNA等等篩選方法篩選方法根據文獻提供根據文獻提供 通過具體實驗篩選通過具體實驗篩選相對定量分析相對定量分析管家基因篩選管家基因篩選P P P P P P O O 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR法法TaqManTaqMan法舉例法舉例TaqMan法研究法研究ERBB2 在乳腺腫瘤在乳腺腫瘤 組織標本中的表達差異組織標本中的表達差異 TaqMan TaqMan法舉例標記探針法舉例標記探針使用使用 TaqMan TaqMan 探針進行雙通道熒光定量探針進行雙通道熒光定量q Fam Fam標記目標基因探針標記目標基因探針q VIC VIC標記看家基因探針標記看家基因探針TaqManTaqMa

30、n法舉例材料準備法舉例材料準備q從正常乳腺組織中提取的總從正常乳腺組織中提取的總 RNA RNA q從乳腺癌組織中提取的總從乳腺癌組織中提取的總RNARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的質粒用于生成標準曲線的質粒用于生成標準曲線q單雙通道同時進行，獨立分析單雙通道同時進行，獨立分析TaqManTaqMan法舉例癌癥標記物表達法舉例癌癥標記物表達Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBBTaqManTaqMan法舉例實驗結果法舉例實驗結果定量定量Copies ng/ l

31、 Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 XGAPDH95500857301360001308001.45 XTaqManTaqMan法舉例實驗結果法舉例實驗結果定量分析定量分析ERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/ 0.011GraphCopies ng/

32、l Total RNATaqManTaqMan法舉例實驗結果法舉例實驗結果表達差異表達差異HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表達差異TaqManTaqMan法舉例實驗結果法舉例實驗結果討論討論通過通過RT-qPCR成功檢測了成功檢測了ERBB2基因在基因在不同組織的表達差異；在乳腺癌組織中，不同組織的表達差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達量是正常水平的的表達量是正常水平的1.8倍倍 雙標準曲線法雙標準曲線法 2 -Ct法法 (CT值比較法值比較法) 相對定量分析相對定量分析兩種常用的分析方法兩種常用的分析方法 通過標準曲線對對

33、照樣品、待測樣品的目的基因及管家通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據計算公式求得相對值即為相對基因進行定量，然后根據計算公式求得相對值即為相對表達量。表達量。 相對值相對值= =校正值校正值= =目的基因定量結果目的基因定量結果管家基因定量結果管家基因定量結果待測樣品的校正值待測樣品的校正值對照樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析相對定量分析雙標準曲線法雙標準曲線法公式：公式：優點：分析簡單，實驗優化相對簡單優點：分析簡單，實驗優化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線應用：基因表達調控研究中最

34、常用與公認的兩種相對定量方法之一應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一相對定量分析相對定量分析雙標準曲線法雙標準曲線法檢測樣品檢測樣品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量結果定量結果定量結定量結果果校正值校正值相對量相對量對照樣品對照樣品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待測樣品待測樣品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待測樣品待測樣品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874實驗數據實驗數據公式：

35、公式：F = 22 2 法法優點：無需作標準曲線優點：無需作標準曲線缺點：假定擴增效率接近缺點：假定擴增效率接近 100 %； 假定標準曲線及每次擴增之際間的效假定標準曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致；率都保持一致；應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一 待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值CtCt實驗數據：實驗數據：Sample 處理前 處理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.40.950.952 - Ct法：法：假

36、設目的基因和參照基因擴增效率都接近假設目的基因和參照基因擴增效率都接近100%Ct（處理前）18171 Ct（處理后）1617.4=1.4Ct=Ct（處理后）Ct（處理前）1.412.4比率（處理后/處理前）=2Ct2（2.4） = 5.3 所以所以JunJun基因在處理后表達水平是處理前的基因在處理后表達水平是處理前的5.35.3倍倍修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于1，那么，那么2Ct可以修正為：（可以修正為：（1E）Ct，例如擴增效率為，例如擴增效率為0.95，那么計算公式可

37、修正為，那么計算公式可修正為1.95Ct2 -2 -CtCt法法內容概要內容概要1 熒光定量熒光定量PCR的原理的原理1 熒光定量熒光定量PCR的標記方法的標記方法1 熒光定量熒光定量PCR的解析方法的解析方法1 SYBR法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項1 TIANGEN公司熒光定量相關產品公司熒光定量相關產品熒光定量熒光定量PCRPCR儀的硬件條件儀的硬件條件激發光源激發光源熱循環加熱、制冷熱循環加熱、制冷 樣品樣品檢測設備檢測設備SYBR法實驗流程及注意事項法實驗流程及注意事項樣品制備樣品制備定量體系配備定量體系配備引物設計引物設計反應條件優化反應條件優化濃度確定濃度確定技能要求技能要求環境要求環境要求誤差控制誤差控制數據分析數據分析儀器介紹儀器介紹RT上機上機反應體系優化反應體系優化試劑選擇試劑選擇分析方法分