1、反相高效液相色譜光電二極管陣列檢測器法測定苦丁茶中烏索酸的含         【摘要】  目的建立苦丁茶中烏索酸含量的測定方法，同時采用光電二極管陣列檢測器檢測烏索酸色譜峰的純度。方法色譜柱為Nucleosil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 m)，流動相為甲醇水(8713)，流速0.8 ml/min，檢測波長210 nm，柱溫26。結果烏索酸在1.63617.724 g（r=0.999 8）范圍內峰面積與進樣量呈良好的線性關系，烏索酸的平均回收率為99.3 % (RSD為1.7 %

2、)。結論 該方法樣品處理簡單，準確度高，分離效能好，適合于苦丁茶葉中烏索酸含量的測定。 【關鍵詞】  苦丁茶；烏索酸；高效液相色譜；光電二極管陣列檢測器Determination of Ursolic Acid in Ilex kudincha by RPHPLCPADZOU Shengqin,  CHEN Wu*,WU XiaochunBioengineering Research Institute of Yichun University·Key Laboratory of Province for Research on Active Ingredient

3、s in Natural Medicines,Yichun,336000,ChinaAbstract：ObjectiveTo develop a method for the quantitative analysis of ursolic acid and oleanolic acid in Ilex kudincha C. J. Tseng and at the same time the purity of ursolic acid peak was detected by means of Photodiode Array Detector(PAD).MethodsHPLC was c

4、arried out on the Nucleosil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 m) at 26 with MeOHH2O(8713) as mobile phase. The flow rate was 0.8 ml and the detection wavelength 210 nm. ResultsThere was good linear relationship between the peak area and the sample content injected in the ranges of 1.63617.724 g（r=0.

5、999 8）for ursolic acid. The average recovery rate of ursolic acid was 99.3% (RSD1.7 %). ConclusionThe method is simple, accurate, and suitable for the determination of ursolic acid in Ilex Kudincha C. J. Tseng.Key words:Ilex kudincha C. J. Tseng ;   Ursolic acid; HPLC;  PAD  

6、;  苦丁茶Ilex kudincha C. J. Tseng為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物，性涼，味甘苦，有散風熱清頭目、除煩渴的功效。苦丁茶主要分布在廣東、廣西、湖南、湖北、海南等地，是我國南部及西南部民間傳統的天然藥用植物，具有清熱解毒、生津、提神、益智、抗衰老、調節血壓、降脂等藥理作用1。苦丁茶主要含三萜類、黃酮類、木脂素、氰基化合物、甾醇、氨基酸和苦味素等化學成分2。藥理研究表明，苦丁茶中的烏索酸具有抗肝炎、抗腫瘤、抗病毒、抗炎抑菌及降血脂血糖等多種藥理活性，具有重要的藥用開發價值3。苦丁茶藥理、化學成分研究已有很多報道，但其質量評價方法報道較少。本實驗采

7、用高效液相色譜法對不同產地苦丁茶產品中的烏索酸含量進行了測定，為評價其質量提供依據。1  儀器與試藥1.1  儀器高效液相色譜儀，Waters515型泵，2996光電二極管陣列檢測器，7725I 進樣閥，Empower 中文色譜工作站（美國）；RO-MB-10D高純水機（杭州永潔達膜分離設備廠）；CP2250分析天平（德國Sartorius公司）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；KS-1500超聲提取儀器（寧波科盛儀器廠）。1.2  試藥甲醇為色譜純（上海陸忠試劑廠），水為高純水，乙醇為分析純（95%，江西同盟試劑化工廠），烏索酸對照品（藥

8、品生物制品檢定所提供，批號110742-200314，供含量測定用）。苦丁茶(市售)，經鑒定為冬青科植物苦丁茶Ilex Kudincha C. J. Tseng的葉。2  方法與結果2.1  色譜條件色譜柱Nucleosil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 m)；流動相為甲醇-水（8713，V/V）；流速為0.8 ml/min；檢測波長為210 nm；柱溫為 26°C。烏索酸理論塔板數大于10000，分離度大于1.5。對照品溶液及苦丁茶樣品溶液的HPLC色譜見圖1。2.2  溶液的制備2.3  線性關系實驗精密吸取對照品溶

9、液2，6，10，14，18 l，按2.1項下色譜條件進樣并測定峰面積。以峰面積對進樣量進行線性回歸，烏索酸回歸方程為：Y=5.62×105X+1.36×105，r=0.999 8。表明烏索酸進樣量在1.63617.724  g之間時，線性關系良好。1         2.4  色譜進樣精密度實驗精密吸取烏索酸對照品溶液10 l進樣，平行5次，測得烏索酸峰面積相對標準偏差（RSD）為0.9%（n=5），表明儀器精密度良好。2.5  方法重現性實驗精密稱取苦丁茶樣品5份

10、，制備樣品溶液，在上述色譜條件下，精密吸取10 l進樣分析，測得烏索酸峰面積的RSD為0.8 %（n=5），方法重現性良好。2.6   加樣回收率實驗精密稱取已知烏索酸含量并干燥至恒重的樣品（廣西欽州）5份，分別加入適量的烏索酸對照品，制備加標樣品溶液，進樣分析，烏索酸加樣回收率。烏索酸平均加樣回收率結果見表1。表1  烏索酸加樣回收率實驗結果（略）2.7  烏索酸色譜峰純度分析選取相同積分參數，采用Empower軟件系統適應性模塊對對照品和樣品溶液中的烏索酸色譜峰積分，分析峰純度，對照品和樣品的烏索酸色譜峰純度圖中純度線均位于自動閾值線下方（圖2），色

11、譜峰純度角值小于閾值，證實烏索酸色譜峰為單一組分吸收峰，與色譜峰頂點、起始點和終止點光譜歸一化疊加后結果相吻合4。2.8  樣品中烏索酸含量測定結果精密稱取苦丁茶樣品約3 g，制備樣品溶液。精密吸取樣品溶液10 l，分別進樣，平行實驗3次，測定烏索酸峰面積，外標法計算烏索酸含量。結果見表2。表2  樣品中烏索酸的測定結果（略）3  討論3.1  植物中烏索酸的提取多采用乙醇回流法、索氏提取法，提取時間長，原料和試劑的使用量大，成本高，且溶劑易揮發污染環境。本實驗嘗試采用超聲提取法，實驗結果表明該法對樣品處理過程簡單，提取率高，與傳統的樣品預處理方法相比，

12、具有快速、環保、高效等優點。3.2  取對照品和苦丁茶樣品溶液進樣，在190500 nm波長范圍進行光譜掃描，烏索酸在流動相中的最大紫外吸收波長均為204.5 nm (圖3)，但由于流動相在短波長處有末端吸收。為了消除背景，提高信噪比，提取不同波長的色譜圖進行比較，選擇210 nm為檢測波長信噪比高，峰形好，干擾小，最大限度地保證了分析結果的準確。3.3  利用二極管陣列檢測器采集立體數據的性能，在分析結果中察看并對比對照品與樣品相應色譜峰的光譜圖，比較兩者的形狀與最大吸收波長，用以增強色譜分析的定性能力，克服了單獨采用色譜峰保留時間定性的缺點，解決了傳統色譜分析過程中定性技術的缺陷5，6。3.4  采用RP-HPLC-PAD法測定苦丁茶中烏索酸的含量，可同時對待測組分的色譜峰進行純度分析。方法準確、靈敏、重現性好、數據可靠，適用于苦丁茶的質量評價和控制。【】  1王 新,陸慧寧,林少琨.苦丁茶冬青葉化學成分及藥理作用研究進展J.天然產物研究與開發,2005,17(3)：366.2蔣建敏,許實波.苦丁茶化學成分和藥理作用研究進展J.時珍國醫國藥,2000,11(1)：92.3陳 武,李開泉,熊筱娟,等.烏索酸的藥理作用研究J.宜春學院學報,