1、基因檢測在肥厚型心肌病診斷、治療及預后評估的應用進展翟姍姍（1） 樊朝美*（2）李一石（3） 肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy，HCM）是指并非完全因心臟負荷異常引起而發生的，以室壁厚度增加為表現的遺傳性心肌病1，亦是青少年及運動員心源性猝死（Sudden Cardiac Death，SCD）的主要原因，故盡早診斷、治療尤為重要。基因檢測有助于HCM早期診斷，但一代測序技術的低檢出率及高成本限制了其在臨床中的應用，近年來二代測序技術（Next Generation Sequencing, NGS）的廣泛應用彌補了一代測序技術的不足。本文就基因檢測在HCM診斷

2、、治療及預后評估的應用進展做一綜述。一、 基因檢測技術的進展 傳統的化學降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎上發展來的各種DNA測序技術統稱為第一代DNA測序技術。因為成本高、速度慢、序列少的第一代測序技術已經不能滿足深度測序和重復測序等大規模基因組測序的需求。所以，以高通量為特點的第二代測序技術應運而生，其原理為邊合成邊測序，可快速并低成本地獲得大規模DNA序列信息。第二代基因測序（Next Generation Sequencing，NGS）主要有以下方式：（1）靶向基因測序（Target Sequencing In Custom Disease-Specific Panels，Targ

3、et-NGS）是對特定疾病的所有已知致病基因進行測序，主要用于診斷；（2）全外顯子測序（Whole-Exome Sequencing，WES）是對基因所有編碼區進行測序，主要用于明確可疑遺傳性疾病的致病突變，尤其是Target-NGS無法測得突變時；（3）全基因組測序（Whole-Genome Sequencing, WGS）是指對全基因組30億bp DNA測序，包括編碼區及非編碼區，主要是用來明確新發致病基因與疾病的關系，在一個個體中可發現成千上萬的突變，其中大部分突變與臨床無明確相關性，應用WGS最大的挑戰是如何找到與臨床密切相關的突變。如何處理二道測序所得龐大數據，如何嚴謹分析并解釋新發

4、突變的致病性均是NGS所應對的問題2。二、 基因檢測在HCM診斷與鑒別診斷中的作用肥厚型心肌病基因檢測最初僅限于實驗室研究，現代基因測序不僅用于HCM的診斷與鑒別診斷，亦可用于優生優育及預后的評估。隨著NGS在HCM中的廣泛應用，不僅能夠發現更多非常見的肌節蛋白突變，還能發現非HCM致病突變如橋粒蛋白突變、離子通常蛋白突變，另外NGS亦可檢出擬表型基因突變。如，Fabry病的半乳糖苷酶基因（-galactosidase A，GLA）突變3，這有助于HCM的鑒別診斷。除此之外，NGS還能夠發現結構變異（Structure Variants，SV）、拷貝數變異（Copy number variat

5、ion, CNV）4，以及表觀遺傳學中DNA甲基化水平和組蛋白修飾因子的改變，探討這些結果的臨床意義將有助于解釋HCM的異質性。三、 基因檢測有助于解釋HCM的異質性HCM異質性突出是臨床面臨的重大挑戰。HCM患者可無癥狀，也可早期發生心力衰竭和猝死，這種異質性可能受以下因素的影響：（1）致病基因不同；（2）致病突變所累及氨基酸位置不同；（3）修飾因子的影響5。 致病突變可能與心室形態相關：早期研究提示HCM的室間隔呈反向曲線形者較乙狀形者的突變陽性率更高（79% 比8%），Bos JM等 6發現其原因在于反向曲線形肥厚的HCM患者多為肌節蛋白基因突變所致，乙狀形肥厚的HCM患者多為Z盤基因突

6、變所致。Lopes LR等7進一步發現細胞膜錨蛋白基因（ankyrin-B，ANK2）所致的HCM患者室間隔最大厚度增加。HCM基因型與心臟核磁共振成像對照研究表明，局部心肌纖維化在基因型陽性的HCM患者中較基因型陰性者中更為常見，而彌漫心肌纖維化與之相反8。以上研究表明，特定蛋白突變或突變數量的改變與HCM心室形態有一定相關性。肥厚型心肌病與其他遺傳性心肌病的致病基因突變重疊：Haas J等9應用Target-NGS技術發現擴張型心肌病、肥厚型心肌病、離子通道心肌病等致病突變的重疊比例很高。Schaefer E等10對一個6月大小猝死的左室致密化不全患者進行NGS測序分析，發現其攜帶肌球蛋白

7、結合蛋白C（Myosin Binding Protein C，MYBPC3）雙復合突變 （Lys505del,、Pro955fs）。Girolami F等11對一HCM合并早發房性心律失常的家系進行Target-NGS分析，檢測到新發的-輔肌動蛋白-2（actinin alpha 2，ACTN2） 為其致病突變，Wang LF等12對一HCM合并長QT綜合征（Long QT syndrome，LQT）的家系進行分析，發現該家系同時存在LQT1與HCM致病突變。通過對SCD高危人群的基因型進行分析發現，其多突變比例較多13。隨著NGS在臨床中的進一步應用，有可能發現更多不同心肌病之間致病基因的重

8、疊現象，這很有可能是所有遺傳性心臟病異質性的一個重要原因。目前關于基因型-表型的關系暫無定論，相信隨著大樣本多中心HCM基因型隨訪研究的開展，將有助于揭示基因型-表型的關系。四、 基因檢測在HCM治療中的作用 4.1藥物治療的新視點藥物、酒精消融術及手術治療可以改善HCM患者的癥狀并提高生活質量。但并不能夠逆轉有病變的心肌，亦不能改善HCM患者的長期預后。為解決以上問題，已開展了一些新治療藥物的探索性研究，并發現氯沙坦、辛伐他汀、螺內酯以及抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸等可以減輕HCM小鼠心肌纖維化程度和減少膠原成分，而這些HCM小鼠均是特定致病突變轉基因所建立的模型。因此，將來基因檢測結果可以影響

9、HCM的治療14。另外，亦有研究表明在MYH7-Arg403Gln或MYH7-Arg719Trp轉基因小鼠發生左室肥厚前，分別給予地爾硫卓、氯沙坦，可以減輕心肌纖維化程度并可延緩左室肥厚的進程14。 目前HCM的早期干預臨床研究相對較少， 近期有人將HCM基因型陽性攜帶者隨機分為地爾硫卓治療組與安慰劑組，2年后發現治療組左心室壁厚度和質量、舒張期充盈、心肌肌鈣蛋白I水平均較安慰劑組有所改善15。相信隨著基因型陽性攜帶者的大規模隨訪隊列研究的增多將能證實HCM早期干預是否有益。 4.2組織工程和再生醫學 HCM新藥開發與設計目前受到兩個方面制約，一是缺少能夠精準體現HCM病理生理的體外模型；二是

10、業已建立的小鼠動物模型與人類基因組存在一定差異。應用相似于正常心肌結構、生物力學的仿生成分與可分化為HCM心肌細胞的多能干細胞進行研究不僅可以加深對HCM發病機制、基因型與表型相關性的理解。而且，還可行特異突變HCM的藥物研究，達到精準治療的目的16。心臟再生工程中成纖維細胞逆轉為正常心肌細胞對于HCM尤為重要，假如在HCM早期就能夠成功逆轉左心室肥厚，就可以減少心肌纖維化、延緩病程、減少心源性猝死，盡管這種逆轉可以實現，但其難度大、效率低。納米技術可攜帶包含逆轉所需的miRNA和轉錄因子的載體靶向定位于HCM患者的成纖維細胞并促其逆轉，從而達到治療目的17，此外，納米技術憑借其高濃度、高選擇

11、性、高通透性、高聯合性等四大優勢，不僅可將特異藥物運送到靶向細胞，還可運送特異的基因，可用于研究HCM特異基因致病機制以及相應的治療方案18。五、 基因檢測在預后評估中的作用 5.1基因檢測可否確定良性與惡性突變早期認為肌鈣蛋白T（Troponin T type 2，TNNT2）、肌球蛋白重鏈 （myosin, heavy chain 7，MYH7）為“惡性突變”， MYBPC3為“良性突變”，以上均為家族性HCM研究，隨后大樣本散發HCM研究發現上述結論并不成立。 MYBPC3與MYH7在發病年齡、肥厚程度、外科手術比例、HCM及猝死家族史等方面并無差異, 隨后Page SP等19也發現MY

12、BPC3并非均晚期發病、預后好，這類基因型的HCM臨床表型仍存在極大異質性，故不能認為MYBPC3屬于“良性突變”。 TNNT2基因型的大樣本隊列研究20發現該突變患者的心血管死亡風險與正常人群無異，將其認為是“惡性突變”亦不合理的。Bos JM等21發現非肌節蛋突變（MLP/TCAP）所致臨床表型與肌節蛋白突變所致HCM并無明顯差別。目前的研究發現HCM基因型陽性者比基因型陰性者預后差7，更易發展為心力衰竭，且發病年齡更早、HCM及SCD家族史更為多見、非對稱性左室肥厚比例較多、左室肥厚程度更重、心血管死亡風險加重。目前HCM的良、惡性基因之分還存在很多爭議，還不能單純依據基因測序來決定HC

13、M的預后，仍需用傳統臨床危險分層的指標來識別HCM的SCD高風險患者。 5.2多突變與預后的關系即使在沒有傳統SCD危險因素時，多突變HCM患者的惡性心律失常、心源性猝死、左室極度肥厚、終末期心力衰竭的發生率等心血管死亡風險均較單基因突變的HCM患者明顯升高22。Girolami F等23提出多突變HCM的臨床表型加重為基因劑量效應所致，即兩種或以上異常基因過度表達疊加產生的效應。但另有研究表明基因突變之間存在相互作用，雙突變或多突變在HCM中的致病機制并非為單純的劑量疊加，而是第二個突變與第一個突變相互作用從而加重表型24。多突變引起表型加重的機制需在分子、細胞、動物實驗中進一步分析，現已發

14、現鈣離子通道調節基因表達下調以及轉錄因子STAT-3的上調與雙突變致病性相關13，這一發現對今后的研究將有極大幫助。隨著NGS的應用，HCM雙突變率從一代測序技術所發現的5%上升到38% ，三突變或更多突變達12.8% 9。雖然還未有研究能證明多突變為獨立的危險因素。但是，未來的大樣本長期隨訪研究將給出明確答案。六、 基因檢測與一級親屬的篩查先證者親屬基因篩查的前提是先證者的致病突變已明確，值得注意的是，采用一代測序技術能夠明確突變的先證者僅占50%，其中很多突變致病性質仍不確定。因此，僅有有限的先證者所在家系可以進行基因篩查。目前基因篩查的主要應用目的為在家族性HCM的家系成員中篩查出基因型

15、陰性的成員并宣告其無發病可能，這樣可以減少其心理負擔和不必要的長期隨訪。但是，HCM的“無罪宣告”需要特別謹慎。同時還需向基因型陰性的成員告知如有不適，也需及時就診。究其原因歸為以下四點：（1）既往認為無或不確定致病性的突變有可能為致病突變;（2）先證者可能為多突變，而基因篩查僅進行單個突變的篩查，遺漏了第二個或第三個致病突變; （3）實驗室等因素的人為錯誤; （4）原始突變，初期先證者并無突變，子代新生的原始突變。總之，HCM家系成員基因篩查的應用看似容易，但其結果的解釋與建議需要多學科合作方能最為優化25。七、 基因測序與優生優育 產前遺傳診斷是指在妊娠初期對患者外周血、羊水及臍帶血等進行

16、基因檢測，有助于早期發現胎兒是否攜帶致病基因，但是該方法除在檢測時機、準確性、安全性諸多方面仍存在問題外，如何處理基因型陽性攜帶者還存在醫學倫理問題。因為并非所有致病基因攜帶者在其一生中均會出現臨床表型。由于產前遺傳診斷在大部分國家非合法，其他手段如收養、人工授精、使用捐贈的配子以及胚胎植入前遺傳學診斷（Pre-Implantation Genetic Diagnosis ，PGD）等有助于優生優育。其中，PGD可以協助遺傳性心肌病的患者孕育不攜帶致病基因的受精卵胚胎，近期Anver Kuliev等對9對遺傳性心臟病的夫妻行PGD發現其應用的優勢及安全性，尤其是對有青年心源性猝死、ICD植入、

17、室性心動過速、心臟移植等家族史的夫妻有一定幫助，但應用PGD之前必須仔細權衡夫妻的需求26。八、 總結與展望基因檢測有助于HCM早期診斷，二代測序技術不僅能提高致病突變檢出率與經濟效益比值，還可發現新發的致病突變及突變形式，并進一步揭示基因型與表型的關聯性。基因檢測在評價HCM預后方面亦有幫助，多突變有可能是HCM患者SCD危險因素之一。盡管心臟組織工程、再生醫學、納米技術處于起步研究階段，但聯合研究將有助于深入了解HCM的發病機制和開發新的治療藥物。參考文獻1Authors/Task Force m, Elliott PM, Anastasakis A, et al. 2014 ESC Gu

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