1、抗體的制備及應用一、抗體的一些基本概念一、抗體的一些基本概念單克隆抗體 (Monoclonal Antibody,McAb) 單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體多克隆抗體 (Polyclonal Antibody) 多個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體 抗原（抗原（antigen ，Ag）表位，抗原結合位點，抗原決定簇（epitope）Ag1234Ag 單克隆抗體 B1B2B3B4B3B3B3B32 多克隆抗體3411、單克隆抗體的特點、單克隆抗體的特點n特異性強，具有抗原結合位點的專一性。（不是抗原的專一性?。﹏因結合位點的單一性，有時不易捕捉抗原，一株單克隆抗體與抗原不易產生凝集反應或沉淀反應。 抗

2、體的性質相同，容易純化、標記。腦垂體分泌的一些激素：hFSH 促卵泡激素hLH 促黃體生成素hTSH 促甲狀腺激素hCG #絨毛膜促性腺激素 單克隆抗體有交叉反應是由于不同的抗原上有完全相同的表位（100%的交叉反應）,或有相似的表位（不同程度的交叉反應）。 產生凝集反應的原理113323221111112232322113購買抗體時要注意廠商的標注適合于做什么實驗,使用濃度多少WB（Western blotting ，免疫印跡)IH (Immunohistochemistry, 免疫組織化學)IC (Immunocytochemistry, 免疫細胞化學)IEM (Immune lectro

3、n microscopy,免疫電鏡)FCM (Flow Cytometry,流式細胞儀)ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶聯免疫吸附實驗,酶聯免疫分析)2、多克隆抗體的特點、多克隆抗體的特點 多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質是一個群體綜合的性質。n特異性一般比單抗差 因為由不同性質的抗體組成，只要其中含交叉反應的抗體，多抗就有交叉反應，所以多抗更容易有交叉反應。n 比單抗更容易捕捉抗原。 因為含有抗不同表位的抗體，多種抗 體都可與抗原結合。n 抗體的純化、標記比單抗難 因為含有各種不同類型、亞類的抗體， 提純、標記的方法有所差別。同時,血 清

4、中含有的雜蛋白比較多.二、抗體的制備二、抗體的制備1、單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備無法采用生物化學的方法從多抗中分離必須采用細胞雜交的方法來制備能否篩選到理想的單克隆抗體有技術問 題也有機遇問題 制備單克隆抗體的基本原理：制備單克隆抗體的基本原理： 致敏的致敏的B淋巴細胞淋巴細胞 骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞 （myeloma） （能夠分泌特異性的抗體 ， （不能分泌特異性的抗體， 不能在體外長期生存 ） 但能在體外長期生存） 陽性雜交瘤細胞陽性雜交瘤細胞 (hybridoma) （既能分泌特異性抗體， 又能夠在體外長期生存）克隆化培養克隆化培養 （產生單克隆的陽性雜交瘤細胞）生產單克隆抗體生產單

5、克隆抗體 12222122、多抗的制備、多抗的制備q常用的免疫動物q免疫的基本步驟q如何免疫兔子1）常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體， 抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但 抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過 程要麻醉動物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地 生產抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產治療用 抗體（商品）。豚鼠（guinea pig）：國外實驗室常用。2）免疫的基本步驟基礎免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全 佐劑（Complate Freund a

6、djuvand , 含礦物油,卡介苗等).加強免疫：第2次以后，抗原量減半，多次， 間隔2-4周，用佛式不完全佐劑 (Incomplate Freund adjuvand , 不含卡介苗).n取血測效價： 加強免疫兩次或三次以后的第7天取血。n放血制備血清： 最后一次免疫后7-10天放血。 (在三角瓶中加一些生理鹽水，放血放置一段時間，凝固，吸取血清，離心，分裝，凍存)3) 如何免疫兔子n2000g(雌雄均可),健康,無病原（小鼠20g，大鼠200g）n基礎免疫0.5ml抗原(含0.250.5mg蛋白或108顆?？乖?0.5ml佛式完全佐劑(CFA)（小鼠0.2ml）制備抗原-佐劑乳化液背部、

7、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）n加強免疫間隔2-4周,可進行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射n免疫34次以后從耳靜脈取血檢測效價酶聯法：1:104以上，能達到1:106。免疫雙擴散： 1:16以上，能達到1:64n效價達到要求的可放血制備血清可一次放血(頸動脈)也可多次取血(耳靜脈) 單抗與多抗的區別單抗與多抗的區別 單抗 多抗抗體組成 單一 復雜 抗體性質 個體的屬性 群體綜合的性質純化標記 容易，效果好 難度高一些 種屬來源 絕大多數是小鼠 兔子、羊、豚鼠等制備周期 長 (最短4個月

8、） 短（2個月）制備技術 復雜 簡單經費 多 少 什么情況需要制備單抗什么情況需要制備單抗n目的蛋白有結構類似物n抗原不純，無法分開n多抗效果不好（已排除非特異性反應）n希望將抗體用于治療，研制成藥品n希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑三、抗體的純化三、抗體的純化q鹽析法（硫酸銨沉淀)q辛酸-硫酸銨沉淀法q離子交換法q親和層析法q凝膠過濾法1、鹽析法、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下,蛋白質在水中的溶解度降低而產生沉淀硫酸銨是最常用的中性鹽不同蛋白質的鹽析常數不同硫酸銨的加入量通常以飽和度表示 (100%飽和度:767g/L)n主要步驟在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀；4高速離心

9、,棄上清,溶解沉淀； 可反復操作,逐級降低硫酸銨的濃度: 50%飽和度: 0.313g/ml 45%飽和度: 0.277g/ml 40%飽和度: 0.243g/ml最后一次離心后,用少量PBS溶解沉淀,透析， 測定濃度。特點成本低，步驟簡單?？贵w的回收率比較高。抗體純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適合于做各種標記。需要高速離心機。2、正辛酸、正辛酸-硫酸銨沉淀法硫酸銨沉淀法n原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白. 正辛酸是一種有機酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀.主要步驟： 調節樣品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),攪拌30分；。 室溫高速離心

10、(10000g，30分鐘),收集上清液； 再加入硫酸銨（40%飽和度）； 4高速離心(10000g，15分鐘) ,棄上清； 溶解沉淀，透析，測定濃度。n特點成本較低，步驟較復雜?？贵w回收率很低?？贵w純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標記。需要高速離心機，耐高速離心的玻璃離心管。3、離子交換法、離子交換法n原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離.DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)將樣品的pH值調至等電點以上,使樣品帶負電荷.采用鹽溶液洗脫,通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分. + - -

11、- - - - - - 帶負電荷 的被吸附上帶負電荷少的先被置換帶負電荷多的后被置換 NaCl Tris 梯度混合儀 連續梯度洗脫: 階段洗脫:T離子強度蛋白濃度T倒入一定濃度的NaCl溶液通過離心來分離n主要步驟 先用硫酸銨沉淀抗體，粗提；將樣品過柱；洗去沒有結合的物質；用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液；紫外分光光度計測量，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。特點 成本較低，步驟較簡單。 抗體回收率較高。 抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標記。 純化后抗體體積大，需要濃縮。 需要冷柜，自動收集器。4、親和層析法、親和層析法n原理利用蛋白質之間的特異性結合

12、 （抗體-抗原，受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結合,捕捉與它相配的物質。洗脫一般采用改變pH值的方法使用前樣品結合(Binding)洗脫(Elution)n主要步驟 將Protein A與活化的柱子相結合(買商品柱)；將腹水或血清處理后過柱；用結合緩沖液洗柱子，直到A280值為零；用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液；測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。葡萄球菌A蛋白 (staphylococcal protein A,SPA)金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白分子量42000,等電點pH5.1可與大多數動物Ig的Fc段結合一個SPA分子有4個相似的活性部位與IgG的結合最強,與IgM,IgA的結合較差 特點 成本高，步驟較簡單。 抗體回收率低。 抗體純度高，適合于各種標記。 純化后抗體體積大，需要濃縮。 需要自動收集器。5、凝膠過濾法、凝膠過濾法(分子篩分子篩)n原理將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質,由于流經路徑的差異,使不同分子質量的組分分離.大分子物質直接從凝膠顆粒外