1、課題 3血紅蛋白的提取和分離導(dǎo)學(xué)案 導(dǎo)學(xué)誘思 1凝膠色譜法凝膠色譜法也稱(chēng)做，是根據(jù)分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)速度不同，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程，移動(dòng)速度；而相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在移動(dòng)，路程，移動(dòng)速度。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。2緩沖溶液緩沖溶液的作用是。緩沖溶液通常由溶解于水中配制而成的。 生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH 下進(jìn)行的，例如：血漿的pH 是，要在實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過(guò)程，必須保持體外的pH 與體

2、內(nèi)的基本一致。3電泳電泳是指。許多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的 pH 下，這些基團(tuán)會(huì)帶上。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子以及分子本身的、的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。兩種常用的電泳方法是和，在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于以及等因素。4蛋白質(zhì)的提取和分離蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：、和。5樣品處理血液由和組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì)，其作用是，血紅蛋白有個(gè)肽鏈組成，包括，其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)，磁

3、基團(tuán)可攜帶。血紅蛋白因含有呈現(xiàn)紅色。紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是，采集的血樣要及時(shí)采用分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的，將下層暗紅色的倒入燒杯，再加入，緩慢攪拌，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放在和作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4 層。第一層為無(wú)色透明的，第 2 層為白色薄層固體，是，第 3 層是紅色透明液體，這是，第 4 層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析取 1mL 的血紅蛋白溶液裝入中，

4、將透析袋放入盛有300mL 的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L 的中，透析 12h。透析可以去除樣品中的雜質(zhì)，或用于更換樣品的。6 凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作（見(jiàn)書(shū)）2）凝膠色譜柱填料的處理（ 1）凝膠的選擇： （）。（ 2）方法：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱(chēng)取一定量的凝膠浸泡于（）中充分溶脹后，配成（）。（ 3）凝膠色譜柱的裝填方法固定：將色譜柱處置固定在支架上裝填：將（）一次性的緩慢倒入（）內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。洗滌平衡裝填完畢后， 立即用緩沖液洗脫瓶，在（）高的操作壓下， 用 300ml 的 20mmol/l的磷酸緩沖液（pH 為 7 0）充分（） 12 小時(shí)。3）

5、樣品加入與洗脫（ 1）加樣前：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關(guān)閉出口（ 2）加透析樣品調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品： 用（）將 1ml（樣品滲入凝膠床： （洗脫：打開(kāi)下端，用磷酸緩沖液洗脫收集：待（）的樣品加到色譜柱的 （）接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，）每（）收集一試管連續(xù)收集思考：你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（）；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大雜質(zhì)

6、蛋白除去，即樣品的（）；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行（）。7. 凝膠電泳法：（ 1）原理：不同蛋白質(zhì)的 _ 不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。思考閱讀教材后，填寫(xiě)下表：決定運(yùn)動(dòng)方向形成庫(kù)侖力形成阻力決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小（ 2）分離方法： _ 、 _等。（ 3）分離過(guò)程：在一定 pH 下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電； 加入帶負(fù)電荷多的 _，形成“蛋白質(zhì) SDS 復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅 _ 。8實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？_ 、 _、 _、 _。思考：是否所有種類(lèi)的蛋白質(zhì)的提取和分離都

7、是這樣的？為什么？_。 _ 。2 選擇實(shí)驗(yàn)材料（ 1）你認(rèn)為鳥(niǎo)類(lèi)血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么？_ 。 _ 。（ 2）請(qǐng)閱讀教材，認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問(wèn)題：血液由和兩部分組成。血細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是。該化合物是由和構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2 和 CO2 結(jié)合的基團(tuán)。3 從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過(guò)程為：洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細(xì)胞的目的是什么？_ ，有利于后續(xù)步驟的分離純化。紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程為血液_ _速短時(shí)離心吸出上層血漿紅細(xì)胞5 倍體積生理鹽水緩慢攪拌10min _ 離

8、心吸出上清液反復(fù)洗滌直至上清液無(wú)_ 色思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？防止 _ ；防止 _；防止 _ 。思考：你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來(lái)？加入 _ ，用玻璃棒 _ 一段時(shí)間。補(bǔ)充：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時(shí)，紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細(xì)胞破碎物、 脂質(zhì)、甲苯有機(jī)溶劑等。 怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學(xué)家采取了離心分離的方法：紅細(xì)胞破碎混合液 _速 _時(shí)離心（ 2000c/min × 10min）濾紙過(guò)濾除去脂質(zhì)分液漏斗分離

9、出血紅蛋白4 如何除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢？。_ 。半透膜的 _性，大分子物質(zhì) _能通過(guò)半透膜，離子和小分子_通過(guò)半透膜。在透析過(guò)程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過(guò)半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到pH 7 的磷酸緩沖液中。思考：為何使用 pH 7 的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？_ 。總結(jié)：通過(guò)以上四個(gè)基本過(guò)程，紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來(lái)。但其中還含有其他種類(lèi)的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等） 。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開(kāi)來(lái)呢？我們來(lái)研究蛋白質(zhì)提取和分離的第二個(gè)步驟粗分離（凝膠色譜操作）。5 凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作_、裝填 _、 _和 _。請(qǐng)閱讀教材：在整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)

10、注意以下事項(xiàng)：（ 1）紅細(xì)胞的洗滌：_ ； _ 。（ 2）凝膠的預(yù)處理：_ ， _（ 3）色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。（ 4）色譜柱成功標(biāo)志： _ 。參考答案一選擇題.A2.3.4.5.6.7.8.9.10.二非選擇題11. 橘皮要浸透，這樣壓榨時(shí)不會(huì)滑脫，出油率高，并且壓榨液的粘稠度不會(huì)太高，過(guò)濾時(shí)不會(huì)堵塞篩眼。12. 適用于提取玫瑰精油、薄荷油等揮發(fā)性強(qiáng)的芳香油。參考答案： 1. D2.A3.A4.D5.D6.D7.C8.B9.A10.D11.B12. 無(wú)色透明；甲苯層；白色薄層；脂溶性物質(zhì)；紅色透明；血紅蛋白；暗紅色13. （ 1）樣品處理；粗分離；純化；純