1、精選優質文檔-傾情為你奉上大鼠灌注取腦用途：1.用于常規HE染色，免疫組化分析。2.冰凍切片可以不做腦組織固定。3.不可用于western blot和PCR。4.如果觀察腦組織的缺血、損傷或其它病變時，不作灌注固定，而是在取出腦組織后作固定，將大大影響效果。原理：心臟灌流術能夠快速沖凈血液并在動物死亡前進行組織的前固定,避免了組織的自溶現象,是腦組織切片觀察的常用方法。多聚甲醛使組織蛋白發生交聯，以保持蛋白的原位和表面結構不變，從而能使其對應的抗體準確檢測其表達位置和量。必要性：1.腦組織較軟，且細胞成分不易保留，腦組織是較易軟化的組織之一，血供也較為豐富，所以最好是在取腦組織前用4多聚甲醛灌

2、注固。2.經前固定后，取腦操作時，可減少腦組織損傷。3.腦內血液都在，HE染色后，可去除紅細胞背景影響。大鼠灌注取腦標準操作規程(SOP)：流程：1) 麻醉 2)開胸 3)心臟左心室穿針,剪開右心耳 4)生理鹽水沖水 5)4%多基甲醛固定 6)取腦 7)保存或切片.具體過程：大鼠經深度麻醉后，固定于自制的手術木板上,置于解剖盤中,開胸暴露并游離出心臟,經左心室插入灌流針并固定, 切開右心耳,先灌注冰凍無菌生理鹽水(4)XmL，直到肝和肺臟顏色轉白及右心房流出液澄清,后再灌注冰凍(4)4%多聚甲醛XmL,斷頭取腦,多聚甲醛浸泡固定24小時。Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法為：4多聚甲醛PB

3、S緩沖液配法：稱取40g PFA溶于裝有500mlDEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續加熱磁力攪拌至6065，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml PBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中），可再檢測一下pH，過濾后定容至1000ml，室溫或4保存備用。簡便方法：先配好PBS，稱好相應的多聚甲醛，37水浴或溫箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55水浴一天，期間不時震蕩。注意，4%的多聚甲醛需臨用前配制,配制后需過濾去除小的雜質,避免心臟灌流時造成栓塞影響灌流效果。2.制作灌注裝置，用兩瓶塑料包裝的輸液瓶裝灌注液。同時配好輸液器備用。3

4、.10水合氯醛按4mL/100g的劑量腹腔注射麻醉動物。4.沿兩側肋弓剪開皮膚，打開腹腔，用一血管鉗夾持劍突并向上提拉，用彎剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小口，造成人工氣胸，然后向兩側順延，剪斷膈肌及肋骨，夾持劍突的血管鉗將劍突連帶胸廓上翻固定，充分暴露心臟，直視下穿刺針左心室心尖處，用血管鉗固定。5.快速滴注生理鹽水(室溫)，同時剪開右心耳。約注入100150mL，至流出液體血色較淺基本澄清，停止灌注。肝臟、眼珠、爪子迅速變白是排出血液的有效觀察指標。6.繼續用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的腦組織置于4PFA置4度冰箱內進行后固定，時間2h，過夜最好。補充：還有一種省時省劑

5、的方法。夾閉腹主動脈：只灌注上肢及頭腦，固定的好又快，又省試劑。先灌注生理鹽水約100ml，見到老鼠兩前肢及兩肺變白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的標志：剛開始灌注時老鼠前肢劇烈抽動（下肢不抽動證明腹主動脈夾閉完全）；前肢及頸部僵硬；所灌注的腦組織白而硬。注意事項：1.多聚甲醛氣味刺激，配置時做好自我保護。2.暴露心臟這一步驟，容易損傷肺、心臟或者肝臟，“夾持劍突并向上提拉，用彎剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小口，造成人工氣胸”，人工氣胸后，肺萎縮，胸腔里的空間增大，提拉劍突后，不容易損傷肺、心及肝臟，出血少。3.經心臟灌注，有時穿刺針會誤進右心室，那樣灌注主要在肺循環起

6、作用，體循環的血液影響不大。所以觀察將穿刺針插入到主動脈內可以確保起到體循環灌注沖洗血液的效果，腦組織的血液沖干凈后，才不會影響免疫組化的效果，不然到處都是紅細胞造成的背景染色。4.灌注時注意排空輸液管中的氣泡不然容易氣栓，影響灌注效果。一定要看到大鼠較劇烈抽搐，不然證明灌注不好。5.關于生理鹽水的溫度的選擇，有人認為因為是快速沖刷血管里的血液，低溫造成血管收縮，灌注的效果反而沒有室溫的好。但是用低溫的認為，低溫有利于組織完整。6.灌注成功的標志：剛開始灌注時老鼠劇烈抽動；成功后老鼠后肢繃直，尾部豎起成一直線；所灌注的腦組織白而硬。7.去顱骨后腦表面有一層硬腦膜,要去掉。常見問題：1.灌注取腦

7、不可用于Western blot及PCR的原因。答：多聚甲醛使組織蛋白發生交聯，以保持蛋白的原位和表面結構不變，從而能使其對應的抗體準確檢測其表達位置和量。Western中，要用去污劑使各種蛋白發生變性、解聚，并變成統一的線性肽鏈，從而能夠用凝膠電泳進行分子量的梯度分離。多聚甲醛會影響蛋白的解聚，從而使其無法用凝膠分離。另外，WB和免疫組化所使用抗體的抗原表位也不同，WB的抗體一般識別蛋白的一級結構，所以可能也無法識別甲醛處理的蛋白。PCR要提RNA，RNA非常容易降解，必須新鮮取組織，然后盡快超低溫冷藏或者馬上抽提，否則非常容易降解。灌注固定的組織，原則上是能夠提得出DNA和RNA的，但是肯

8、定會有較多的降解，一般不會這樣做。2. 沒有灌注固定的大鼠腦組織,能不能做切片和免疫組化？答：如果沒有灌注固定，而是直接取材然后放入固定液中，可以進行免疫組化染色，只是效果不如灌注固定的好，尤其是要做電鏡時更明顯。有的標記蛋白要求較高，固定不好就難以染好。3. 用4%多聚甲醛固定但保存了2周才做石蠟切片，不知對免疫組化有無影響？答：固定時間過長蛋白多肽鏈都交連在一起了,抗原性就很弱了，很可能沒有陽性結果,抗原修復時一般的修復很難把抗原性恢復. 可能會有影響，但不會太大。固定時間長，抗原修復時間也要長一些。4.灌注多長時間？灌注液多少？看了很多經驗，每個人的灌注液用量都不一樣，灌注速度也能沒有很

9、清楚的說法，灌注時間也不確定。我的總結為，還是看灌注成功的標志。現將看到的比較詳細的處理方法列出。灌注速度，大家比較公認的是先快后慢。短期灌注：采用心臟穿刺快速灌注20 min,其中生理鹽水灌注50100mL,4 %多聚甲醛緩沖液灌注150 mL。長期灌注：灌注時間延長到1 h,其中生理鹽水灌注200mL,4 %多聚甲醛緩沖液灌注400 mL。短期灌注組腦組織結構保留基本良好,與長期灌注組相比稍差,研究皮層和海馬結構損傷基本可以滿足;長期灌注組結構保留最好,但是耗時長、固定液用量大,致使試驗進度慢等缺點不容忽視。,對皮層和海馬缺血再灌注損傷研究選擇短期灌注取腦尚可滿足需要,深部腦白質及核團缺血

10、再灌注損傷研究還是要用長期灌注固定取腦法,或者在取腦后立即根據實驗取材要求將腦切成塊再浸泡入固定液充分固定。下面是夾閉腹主動脈:每只大鼠先快速推注生理鹽水50 ml沖洗,繼而灌注固定液(如4%多聚甲醛等)5080 ml,先快后慢,需1015 min,在灌注固定液過程中,頸部逐漸變硬;灌注結束后,開顱取出腦組織,置于固定液中后固定24 h。5. 體循環與肺循環的鑒別？體循環時大鼠肝臟變白現象出現較早,在灌注多聚甲醛后,四肢會出現明顯的抽搐現象,尾巴和四肢明顯僵硬。若灌流針誤插入右心室,會導致灌流液沿肺循環途徑灌流,這時肝臟變白出現的較慢,四肢的抽搐現象沒有體循環明顯,且鼻腔中有時會有灌流液流出。因肺循環會影響組織器官的灌流效果,因此進針時要準確,避免肺循環的發生。一旦出現肺循