1、（二）食品添加劑的通用名稱、功能分類、用量和使用范圍1. 通用名稱通用名稱來源a供體b果膠裂解酶里氏木霉黑曲霉PectinlyasTrichoderma reeseiAspergillus niger本文敘述的果膠裂解酶是通過里氏木霉發酵生產的， 該里氏木霉攜帶有來自黑曲霉的果膠裂解酶編碼基因。2. 功能分類果膠裂解酶收錄于 GB2760-2014食品添加劑使用標準中， 為允許使用的食品用酶制劑，其來源的微生物為黑曲霉。本次申報的果膠裂解酶來源于里氏木霉， 該菌種未收載在 GB2760-2014規定的果膠裂解酶來源的微生物名單中。 因此，特申請里氏木霉來源的果膠裂解作食品用酶制劑新品種。3.

2、使用量和使用范圍最大使用量食品分類號食品名稱備注(mg/kg ）14.02果蔬汁類及其飲料按生產需要適量使用15.03.03果酒按生產需要適量使用04.01.02.06果泥按生產需要適量使用15.03.01葡萄酒按生產需要適量使用依據現行良好生產規范（GMP）要求，建議以達到預期效果的最小添加量使用該酶。（三）證明技術上確有必要和使用效果的資料或者文件 食品添加劑的功能類別、作用機理1、功能類別本次申報的果膠裂解酶功能為食品用酶制劑，主要用于果蔬汁類及其飲料、果酒、果泥、葡萄酒的加工。我國食品添加劑國家標準 GB2760-2014已收載來源于黑曲霉的果膠裂解酶，并廣泛應用在食品加工中。但 AB

3、EnzymesGmbH出品的果膠裂解酶來源于里氏木霉，與 GB2760-2014規定的果膠裂解酶菌種來源不同， 因此特申請里氏木霉來源的果膠裂解酶作為食品用酶制劑。2、作用機理果膠酶是一類分解果膠物質的酶的總稱。常見的果膠酶有三種： 果膠裂解酶（ PL）、果膠甲基酯酶（ PE）及多聚半乳糖醛酸酶（ PG）。果膠的分解可通過兩種不同的機理實現： PE/PG模式和 PL模式。果膠結構及果膠酶的作用如下圖示： PE/PG 模式果膠甲基酯酶（ PE）可隨機切除甲酯化果膠中的甲基產生甲醇和游離羧基，該過程對于果膠溶液的粘度幾乎沒有影響。多聚半乳糖醛酸酶（ PG）能切斷果膠酸的-1,4 糖苷鍵，促進聚半乳

4、糖醛酸鏈水解。 PG 酶根據水解機理分為內切酶及外切酶兩種，內切酶從分子內部無規則的切斷 -1,4 糖苷鍵，可使果膠粘度迅速下降； 外切酶從分子末端逐個切斷-1,4糖苷鍵，粘度下降不明顯。PE 酶去甲酯化，是 PG 酶繼續作用進一步分解果膠鏈的前置條件。因此，PE、PG 酶是復配作用的。果膠甲基酯酶（ PE）和多聚半乳糖醛酸酶（ PG）共同作用，稱之為PE/PG 模式。首先由果膠甲基酯酶去除甲基，形成果膠酸及游離的甲醇；然后多聚半乳糖醛酸酶進一步作用將果膠酸分解成小分子，最終達到將果膠大分子分解成小分子的作用。該過程產生的游離甲醇會殘留在最終成品中。對于果膠含量高或者酯化度高的果蔬品種，比如紅

5、棗、山楂、藍莓等，控制成品的甲醇含量成為一個難題。市場上的果膠分解酶基本上都是此種類型。 PL 模式果膠裂解酶通過反式消去作用切割 -1,4 糖苷鍵，在半乳糖醛酸的非還原末端形成 C4 和 C5 不飽和鍵。果膠裂解酶是唯一通過反式消去作用降解高酯化果膠的果膠酶，而不需要果膠酯酶的酯化作用。AB Enzymes GmbH出品的果膠裂解酶即為該類型，其對果膠的分解是在沒有預先去酯的情況下， 以反式消去的模式進行， 可快速降低粘度， 不會產生甲醇和半乳糖醛酸。 里氏木霉來源的果膠裂解酶與黑曲霉來源的果膠裂解酶的使用效果比較1、里氏木霉來源的果膠裂解酶與黑曲霉來源的果膠裂解酶在果蔬汁及其飲料中的使用效

6、果對比資料與黑曲霉（包括重組黑曲霉）來源的果膠裂解酶相比，本品有諸多優勢（具體試驗報告見 附件 1），如下：作用時間更短， 可以更快的降低果汁粘度，加快過濾速度， 提高出汁率及產品澄清度，特別適用于需要快速降低粘度的產品加工（如橙汁加工）；使用本品的產品具有更好的壓榨性能，縮短了加工時間， 有效提高了生產能力，有利于降低生產成本、提高生產效益；使用本品的產品中甲醇的含量更低；使用本品的產品具有更好的質量穩定性，有效延長了保質期。表 1 不同來源的果膠裂解酶在果汁中的應用效果對比果膠裂解酶果膠裂解酶指標（里氏木霉）（黑曲霉）酶作用機理反式消去作用反式消去作用作用條件更寬比較有限作用條件要求（ p

7、H 值： 3.0-6.0 ）（ pH 值： 3.0-4.5 ）酶活性作用速度30 秒210 秒（粘度降至30%）粘度降至初始水平的 27%降至初始水平的 78%30s 內）（作用時間出汁率93.5%92%甲醇含量0.2-0.3%1.5-2.0%NTU （ 12°BX ）0.782.6產品質量60%50%透光率（榨機出來的濁汁）濁度變化（ NTU ）+0.38+1.0穩定性色值變化（ 37保溫 7 天）-40%-50%保質期3 年2 年榨機充填量（噸 /時）13-1410-12生產能力產能（噸 /時）98能耗更低普通2、里氏木霉來源的果膠裂解酶與黑曲霉來源的果膠裂解酶在果酒中的使用效果

8、對比資料略，涉及保密內容。3、里氏木霉來源的果膠裂解酶與黑曲霉來源的果膠裂解酶在果泥中的使用效果對比資料略，涉及保密內容。4、里氏木霉來源的果膠裂解酶與黑曲霉來源的果膠裂解酶在葡萄酒中的使用效果對比資料略，涉及保密內容。 在擬添加的食品中添加與否的效果對比略，涉及保密內容。 本品給食品加工業帶來的進步性變化作為世界四大酶制劑之一，果膠裂解酶已被廣泛應用于果蔬加工、釀酒、茶與咖啡發酵、榨油以及天然產物的提取等食品行業中。作為食品用酶制劑，果膠裂解酶可以快速降解果膠物質，降低原料加工難度、提高營養價值、改善產品質量及貯藏穩定性。食品工業作為中國國民經濟的支柱產業之一，隨著其持續、快速的發展，果膠裂

9、解酶的市場空間迅猛增長，需求巨大。但是，目前國內食品級果膠裂解酶主要來源于黑曲霉，來源單一、產率低、活性有限等問題已成為制約其產業化及應用的技術瓶頸之一，產量和功能遠遠不能滿足國內日益增長的食品工業市場需求。作為世界上最早成立（ 1907 年）且最為知名的酶制劑公司之一，ABEnzymesGmbH自 1990 年就開始了果膠裂解酶的研究。研究發現里氏木霉具有表達量大、胞外蛋白質分泌率高和無毒、無害等特性， 是理想的異源重組蛋白表達宿主。公司利用基因工程技術，構建了高效的果膠裂解酶分子改良和表達技術體系，實現了黑曲霉果膠裂解酶基因在里氏木霉菌株的高效、安全表達，不僅拓展了果膠裂解酶的安全來源、提

10、高了酶活性，同時降低了生產能耗和成本，有利于提高其市場競爭力，推動果膠酶產業的發展，從而滿足食品工業的巨大需求。 國外批準使用現狀如本文所述，里氏木霉來源（包括轉基因）的果膠酶已得到國際食品界認可。澳新食品標準局已批準里氏木霉來源的果膠酶作為食品加工助劑使用，參見澳大利亞新西蘭食品標準法典第條-加工助劑，網址如下：。本次申請的果膠裂解酶（源于里氏木霉） ，已于 2000 年 4 月通過美國 FDAGRAS 認證（RAS/NoticeInventory/ucm265974.pdf ），作為無需限制使用的安全食品添加劑，用于果蔬、谷物和咖啡等的加工。以本品為主要成分的果膠裂解酶制劑自 1995 年

11、開始在歐洲各地銷售，自 2000 年開始在美國銷售，現已得到廣泛的安全性應用，深受食品加工業的普遍歡迎， 年銷售收入達 8 千萬人民幣， 客觀證明了果膠裂解酶在食品生產中的安全、 有效和廣泛需求。 迄今為止， 尚未發現任何與安全有關的案例。另外，本品果膠裂解酶已向歐盟委員會遞交申請， 作為食品酶制劑用于果蔬、果酒、咖啡以及谷物加工，預計在年內將獲得歐盟批準上市。鑒于中國巨大的市場潛力， 本公司特向中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會遞交申請，批準其作為食品用酶制劑用于果蔬、葡萄酒等的加工。 產品已發表的相關文獻Olempska-Beer 等人 1 （2006）在發表的文章中 ,對本次申請的果

12、膠裂解酶的批準狀況進行了綜述。（四）質量規格要求、 生產使用工藝和檢驗方法，食品中該添加劑的檢驗方法或者相關情況說明 質量規格編制說明1、標準編制依據本果膠裂解酶產品的質量規格符合聯合國糧農組織和世界衛生組織的食品添加劑聯合專家委員會（ JECFA）和美國食品化學制品藥典（ FCC）關于食品用酶制劑的的規定， 同時也符合我國關于食品用酶制劑的相關要求。 產品質量規格的制定主要參考了以下國際 /國內標準：JECFA：食品加工用酶制劑通用標準；FCC 第 7 版：酶制劑的一般要求和額外要求；GB25594-2010食品安全國家標準食品工業用酶制劑；衛生部 2009 年 11 號公告：關于公布食品添

13、加劑新品種的公告 （果膠裂解酶）。質量規格中酶活性的檢驗方法按照附錄A 的方法執行。2、與國際組織和其他國家（地區）相關標準的比較目前，國際上還沒有以該重組里氏木霉為來源的果膠裂解酶產品的相關標準，因此沒辦法做對比。 質量規格要求名稱：果膠裂解酶Pectinlyase來源：里氏木霉 Trichoderma reesei供體：黑曲霉Aspergillus niger1、生產工藝以轉基因里氏木霉生產菌在嚴格控制的條件下進行液體深層發酵制備而成的果膠裂解酶。2、性狀棕色液體，產品顏色隨批次不同略有不同。3、 技術指標 理化指標應符合表 1 規定。表 1理化指標項目指標酶活性 /( PTF/mg)10

14、0重金屬 /(mg/kg)30鉛 /(mg/kg)5砷 /(mg/kg)3真菌毒素不得檢出備注：酶活性規格除以上規格外，還可按實際需要執行。 微生物指標應符合表 2 規定。表 2微生物指標項目指標菌落總數 / (cfu/g)50000大腸菌群 /(MPN/g)30沙門氏菌 /25g不得檢出致瀉大腸埃希氏菌 /25g不得檢出抗生素活性不得檢出生產菌不得檢出附錄 A吸光光度法測定果膠裂解酶活性1、適用范圍此方法適用于測量果膠酶中果膠裂解酶的活性。2、定義在試驗條件下，以每分鐘在 235nm 波長下吸光度增加 0.01 為 1 個果膠裂解酶活性單位，通常用 PTF/mg 來表示。3、試劑本方法中所用

15、水為去離子水、 超純水；所用試劑在沒有注明其他要求時， 均指分析純試劑。 檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液（pH=5.8）稱取 35.6g 磷酸氫二鈉二水合物 (Na2HPO4·2H2O)，用容量瓶定容至1000mL。稱取 21g 一水檸檬酸，用容量瓶定容至1000mL。在測試當天將上述溶液以57:43 的比例混合，檢測 pH=5.8。通過添加上述其中一種溶液調整pH 值。 0.5%果膠基質溶液稱取 5g 果膠（哥本哈根果膠）至燒杯中，加入20ml 純乙醇或者96%濃度的乙醇，然后使用電磁攪拌器混合均勻。緩慢加入（2 分鐘內） 800mL 的上述緩沖液，繼續攪拌30 分鐘（不要產生泡沫） 。調節

16、 PH 值至 5.8 后，用緩沖液定容至 1000mL。以 12000rpmm 的速度離心 10 分鐘。基質在 -20凝固存儲。在冷凍前應檢查溶液吸收率（應該為 <2）。4、儀器和設備 分析天平 電磁攪拌器 分光光度計，如 UV-1601 離心機5、分析步驟 待測酶液的制備稱取 200-500mg 樣品用檸檬酸磷酸鹽緩沖劑稀釋，全部移入容量瓶中，定容。吸光度的變化應為 0.01-0.03（理想值為 0.02-0.03）每分鐘。在每份樣品中準備 3 份相同的重量。 測定設置分光光度計相關參數，用水溶液調零。用移液器吸取3.0ml 基質溶液到比色皿中并在 30下預熱 15 分鐘。然后加入 1

17、00 l 待測酶液，封口，翻轉混合。在 235nm 波長下測定 8 分鐘內的吸收率變化。6、計算在線性范圍內（至少長達5 分鐘）測量吸收率的增加。A= 吸收率的差異m=溶液中樣品的數量（ mg）t=時間（ min）請知悉：島津 UV-1601 測量 A/t 的數值。上述酶活性檢驗方法的方法學驗證報告詳見附件 2。 生產工藝果膠裂解酶的生產工藝，包括發酵、純化（回收）、配制以及成品的質量控制。本節描述本產品生產中所應用的各種生產工藝。注：1.流程控制圖中的控制步驟可能會根據生產過程中產品生產計劃而有所變動。2.微生物控制：通過顯微鏡和平板計數確保無微生物污染。3.發酵過程中的參數例如pH 、溫度

18、、氧氣、二氧化碳、無菌空氣的流通是受監測的。4.后處理過程中的操作控制包括監測和控制參數例如pH 、溫度控制以達到質量評價中釋放的標準。5.檢驗產品是否符合質量標準。1、發酵果膠裂解酶是通過轉基因里氏木霉深層發酵制備生產的。 發酵原料只有檢驗合格的原料才可用于生產。發酵工藝（種子培養、種子罐、主發酵及補料）中所使用的原料如下所列：飲用水碳源氮源鹽類和礦物質（硫酸銨、磷酸二氫鉀）pH 調節劑泡沫控制劑 發酵環境的控制所有設備均經過謹慎的設計與構建，以阻止外源微生物的污染。所有發酵工藝中未使用的閥門和連接裝置，均在 120以上的蒸汽中密封保存。高壓滅菌后，發酵罐內維持一定的正壓力。將通氣用空氣通過

19、無菌過濾器，對其進行滅菌。在每個發酵工藝前，清洗每個發酵罐的內側。所有發酵罐、容器和管道使用后用在線清潔系統（ CIP）進行沖洗，并在清洗過程完成后進行檢查。 菌種保藏生產菌株的培養物在甘油中于-80保存。接種之前，生產菌株的原種培養物按照下列參數進行質量控制：菌種確認、無污染微生物、活菌計數、產酶能力。 接種物將生產菌的培養物混懸液以無菌方式轉移到含發酵培養基的搖瓶中。為了獲得足夠的生物量， 重復該流程數次。 獲得足夠的生物量之后， 合并搖瓶內容物用于接種種子發酵罐。 種子發酵接種物以無菌方式轉移到試點發酵罐中，隨后再轉移到種子發酵罐中。 在恒定的溫度和固定的pH 下進行種子發酵。 主發酵種

20、子發酵罐培養物經無菌操作轉移至主發酵罐中， 通過標準的深層發酵法在主發酵罐中進行發酵。在主發酵過程中， 生產菌株進行果膠裂解酶的生物合成。 發酵流程應該持續到預定的時間，或者直到實驗室檢測數據顯示已經獲得理想的酶產量或者酶的生產速率已經降低到預定的生產速率以下。滿足這些條件時，發酵結束。主發酵的控制參數如表3 所示。表 3主發酵罐工藝操作控制參數操作培養基滅菌蒸汽噴射滅菌（ 121°C，至少20 分鐘）培養基測量 pH 值，需要時調節pH 值滅菌后分析溫度在明確的溫度下發酵通氣培養基由滅菌空氣通氣壓力保持發酵罐中的正壓力發酵pH 值控制并調節CO2始終檢測分析pH 值每隔一段時間測定

21、一次酶活力每隔一段時間測定一次微生物分析在接種之前和發酵過程中， 樣品要嚴格控制微生物控制步驟中， 必須控制外源性微生物的量。 從種子發酵罐和主發酵罐中取樣（接種之前、培養過程中定期、轉移或收集之前），進行顯微鏡檢查或平板計數分析。同時密切監測相關發酵參數，如酶活力和pH 值，偏離正常的發酵工藝可能意味著有染菌。2、回收回收的目的在于從發酵液中分離出所需要的酶，然后對酶進行純化、濃縮。本工藝步驟包括一系列單元操作，包括預處理、固液分離、濃縮、拋光和細菌過濾。不同酶生產廠家，該單元操作的性質、數量和順序可能各不相同。 回收原料回收工藝中所使用的原料如下所列：? 絮凝劑? 助濾劑? pH 調節劑回

22、收流程中除了上述材料之外還可以使用飲用水。 預處理如果需要時，可加入絮凝劑或助濾劑以方便初步分離過程。 助濾劑的用量通常為 2.5%。 固液分離通過離心或過濾等技術，將細胞群和其他固形物從發酵液中分離去除。工藝中使用的助濾劑為食品級硅藻土。在規定的 pH 和溫度范圍內進行固液分離，以便最大限度地減少酶活性的損失。 濃縮使用超濾和蒸發對酶進行濃縮和進一步純化， 以獲得期望的酶活性、 增加活力 /干物質比。在濃縮過程對溫度和pH 進行控制，直到獲得所需的濃度。 拋光和細菌過濾為了去除殘留的生產菌并作為一般性的防微生物降解措施， 使用專用的微生物過濾器進行過濾。預過濾（拋光過濾）為可選項，可用于清除

23、不溶性雜質并促進細菌過濾。該單元操作可以去除生產菌及其他來自發酵的不溶性雜質。3、配制和包裝依據產品質量標準，配制標準化酶制劑產品。4、產品控制分析每批產品以確保果膠裂解酶制劑的質量。產品控制標準包括 pH、酶活性、微生物純度等。 該食品添加劑在食品中的生產使用工藝根據不同食品生產工藝和工序使用該酶制劑。 下面給出了果膠裂解酶用于果蔬汁、葡萄酒、果酒、果泥加工過程的工藝流程圖供參考。1、果膠裂解酶在果蔬汁中的生產使用工藝果膠裂解酶及其它果膠酶的復合酶制劑通常用于果蔬加工。 在對原料進行處理時，可用于果實脫皮；在處理果漿時，可有效降低黏度、改善壓榨性能，提高出汁率和營養成分含量； 在進行沉淀、 過濾和離心時， 可破壞果汁中懸浮的穩定性，提高超濾的通量，縮短超濾時間，降低非酶褐變，穩定果汁，保證良好的貯存穩定性和質量要求。 由于果膠裂解酶可