1、二甲雙胍對糖尿病大鼠心肌病變的抗氧化保護作用    【摘要】  目的 探討二甲雙胍(MT)對2型糖尿病大鼠心肌病變的抗氧化保護作用。方法 雄性SD大鼠45只，高脂高糖喂養6周后，予以鏈脲佐菌素(STZ)35mg/kg腹腔注射制備2型糖尿病動物模型，隨機分為對照組(CG)、單純糖尿病組(DG)、小劑量MT干預組(SM，100mg/kg·d灌胃)及大劑量MT干預組(LM，300mg/kg.d灌胃)，灌胃12周后，血清檢測胰島素(INS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CH)及游離脂肪酸(FFA)，心肌勻漿檢測超氧化物歧化酶(SOD)及丙

2、二醛(MDA)水平，應用免疫組織化學方法測定核因子(NF-B p65)及環氧化酶-2(COX-2)在心肌中的表達，并觀察各組心肌細胞超微結構變化。結果 1)與對照組比較，DG組體重明顯減輕，血糖、心臟質量指數、INS、TG、T-CH及FFA明顯升高(P0.01)；應用MT治療后體重無明顯增加，INS有所下降，心臟質量指數、血糖、TG及FFA明顯降低(P0.01)；DG組心肌組織MDA明顯升高，SOD明顯降低(P0.01)，MT治療后上述指標明顯改善；2)超微結構觀察單純糖尿病組肌絲結構明顯紊亂，典型肌小節結構消失，線粒體腫脹、間質纖維增生，微血管內皮細胞腫脹等表現，而SM及LM組可見組織結構有

3、所改善；3)對照組心肌NF-B p65及COX-2只有少量表達，單純糖尿病組表達量明顯增多(P0.01)，MT治療后表達量明顯減少(P0.01)。結論 MT對糖尿病心肌病變具有保護作用，可能與其減弱脂質的過氧化反應，減少NF-B及COX-2的表達有關。 【關鍵詞】  二甲雙胍；糖尿病大鼠；心?。豢寡趸疧bstract： Objective  To explore the protective effect and investigate anti-oxidative stress mechanism of metformin on diabetic myocardial d

4、amage in rats. Methods  The model of diabetes in 45 male SD rats was establised through intraperitoneal injection streptozotoch(STZ) 35mg/kg after six weeks by feeding high fat and high glucose food. 45 rats were randomly divided into control group group(CG)、Diabetic group(DG)、small dose metfor

5、min group(SM,intragastric administration with metformin 100mg/kg·d）and large dose metformin group(LM, intragastric administration with metformin 300mg/kg.d ).All groups was taken blood sample to detecte insulin 、blood fat and free fatty acids and prepared myocardium homogenate to detecte activi

6、ty of superoxide dismutate (SOD) and malondialdehyde(MDA) and analyze the express of NF-B p65 and COX-2 in myocardium by immunohistochemical analysis,observe myocardial ultrastructure at the end of 12 weeks. Results  1)compared with the control group,body weight decreased significantly and bloo

7、d glucose 、heart index 、insulin、cholesterol、triglyeride and free fatty acids in DG group increased significantly（P0.01）. Compared with DG group, the level of insulin , heart index 、blood glucose、triglyeride and free fatty acids were cut down significantly after treatment with large or small dose met

8、formin（P0.01）.MDA increased and SOD deceased in myocardium tissues of diabetic group and the difference had significant difference compared with the control group（P0.01）. 2)Myocardial ultrastructure was normal in the control group,myoneme arranged disordered,the structure of typical sarcomere disapp

9、eared, mitochondrium intumesced,interstitial substance fiber hyperplasy,capillary vessel endothelial cell swelled in DG group.Myocardial ultrastructure improved slightly in rats of SM and LM groups. 3)NF-B p65 and COX-2 had a small quantity to present in the myocardium tissue of control group,while

10、the quantity increased obviously in the diabetic group.The level of it in the group of treatment was significant lower than that in the diabetic group.There was significant difference between the two groups. Conclusion  Metformin can protect against the heart injury in diabetic.The mechanisms m

11、ay be associated with inhibition of lipid peroxidation which can decreased the secretion of NF-B and COX-2 evoked by oxidative stress.Key words： metformin；diabetes mellitus；myocardium；anti-oxidative stress    在糖尿病(DM)的諸多慢性并發癥中，糖尿病性心肌病的危害最大，但由于其病因復雜，臨床診斷及治療困難，目前尚無治療該病的特效藥物。二甲雙胍(Metform

12、in，MT)是較傳統的降糖藥，近年由于其在心血管方面的突出作用，對此藥的研究日趨深入，特別是對其潛在非降糖機制的研究頗多1-2。本研究以高脂高糖喂養加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立的2型糖尿病動物模型為研究對象，觀察MT對心肌在抗氧化方面的作用。1  材料與方法1.1  材料1.1.1  實驗動物 清潔級近交系Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠45只(由寧夏醫學院實驗動物中心提供)，8周齡，體重為(220±20)g，實驗動物許可證號：SCXK(寧)2005-0001。1.1.2  主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購自Sig

13、ma公司；二甲雙胍為天津中新藥業股份公司生產；兔抗鼠NF-B p65及COX-2多克隆抗體購自武漢博士德公司；MDA、SOD、FFA試劑盒為南京建成生物工程研究所的產品；血漿胰島素ElASA試劑盒購自大連泛邦試劑公司；微量血糖儀由羅氏公司提供；透射電鏡型號為HITACHI H-600。1.2  方法1.2.1  動物模型建立及分組 對照組10只大鼠飼以常規飼料，實驗組35只飼以高脂高糖飼料(10%豬油、20%蔗糖、2%蛋黃粉、1%膽鹽、67%常規飼料)。喂養6周后，實驗組大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈脲佐菌素35mg/kg(以pH4.5、0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液配制成20g/

14、L溶液)；對照組僅注射等容積的枸櫞酸緩沖液，注射1周后，監測大鼠尾尖血糖，以血糖11.1mmol/L作為糖尿病成模標準，按以上標準剔除未成模鼠4只，成模率為88.6%，將成模糖尿病大鼠隨機分為三組：單純糖尿病組10只、小劑量MT干預組11只(SM組)及大劑量MT干預組10只(LM組)。SM及LM組分別予二甲雙胍100mg/(kg·d)及300mg/(kg·d)溶于1mL生理鹽水灌胃治療，對照組及單純糖尿病組予以等容積生理鹽水灌胃，每日1次；所有大鼠分籠喂養，充分供給食水，每周測1次尿糖和體重，每月測1次血糖，成模后共觀察12周。1.2.2  觀察指標 于灌胃后12

15、周時進行標本收集，先測尾尖空腹微量血糖，然后用20%烏拉坦溶液按5mL/kg腹腔注射麻醉，剖開胸腹，心內采血，迅速取出心臟，冰鹽水沖洗，濾紙吸干，稱量心臟重量，計算心臟質量指數(心重mg/體重g)。(1)分離血清按試劑盒說明分別檢測INS、TG、T-CH及FFA；(2)制備心肌勻漿檢測：心肌組織SOD、 MDA(按說明書嚴格操作)，計算抗氧化比值AOR=SOD/MDA；(3)心肌電鏡觀察：于左心室前壁取1mm3心肌組織經戊二醛及鋨酸雙固定，梯度乙醇系列脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片觀察超微結構變化；(4)NF-B p65及COX-2的免疫組化染色(SABC法)：嚴格按說明書操作，NF-B p65

16、為胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色片狀或顆粒狀染色為陽性結果，COX-2為細胞胞漿或間質著色為陽性，在image pro-plus 6.0病理圖像分析系統下，測定陽性區域的面積及平均光密度，計算累積光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度。1.3  統計學方法 計量數據以均數±標準差(x±s)表示，多組間均數比較采用方差分析，所有數據用SPSS 11.5統計軟件處理。2  結果2.1  各組大鼠一般情況比較    對照組組大鼠精神狀態良好，毛色白有光澤，無死亡；單純糖尿病組大鼠均出現多飲、多食和消瘦等癥狀，且精神

17、萎靡，毛色干枯；實驗結束時，單純糖尿病組死亡2只，血糖恢復正常1只；SM組死亡2只，LM組死亡1只。2.2  各組大鼠檢測指標的比較(表1)表1  各組大鼠檢測指標的比較(略)    與對照組比較，單純糖尿病組及SM、LM組體重均明顯減輕，差異有統計學意義(P0.01)；單純糖尿病組心臟質量指數明顯增加，應用MT治療后顯著減少(P0.01)；單純糖尿病組TG、T-CH明顯升高(P0.01)，治療后可見TG明顯降低，LM較SM組減低更明顯，與對照組比較差異無統計學意義(P0.05)，而TCH變化不明顯；單純糖尿病組血糖、INS明顯升高(P0.01

18、)，治療后有明顯下降，但與對照組比較仍偏高(P0.01)；單純糖尿病組可見血FFA及心肌MDA明顯升高，SOD、AOR明顯降低(P0.01)，SM組上述指標有所改善，而LM組改善更顯著。2.3  心肌細胞電鏡表現(圖1)     對照組(圖1a)心肌肌絲結構清晰，肌小節及其Z線、M線結構清晰，肌絲間線粒體排列整齊，嵴結構清晰，排列密集；單純糖尿病組(圖1b)心肌肌絲結構明顯紊亂，典型肌小節結構消失，線粒體腫脹，內有斷嵴、空泡樣變性現象，粗面內質網擴張，間質纖維增生，偶見閏盤斷裂，微血管內皮細胞腫脹，凸入管腔，管腔狹窄，基底膜呈節段性增厚；而SM組(圖1c

19、)與單純糖尿病組比較，肌絲結構有所改善，但走行仍欠規整，可見肌小節和Z線，線粒體腫脹明顯減輕，心肌間質纖維減少，微血管基底膜增厚減輕；LM組(圖1d)肌絲結構較清晰，閏盤完整，但線粒體仍輕度腫脹，內有少許空泡變性。2.4  免疫組化結果    對照組心肌NF-B p65微量表達，多為胞漿黃染；而糖尿病組NF-B p65表達明顯增多，陽性細胞呈棕黃色，定位于細胞核，兩組差異有統計學意義(P0.01)，治療12周后可見SM、LM組IOD值降低，P0.01(表2、圖2 AD，見封3)。    COX-2在 對照組中只有少量表達，糖

20、尿病組表達量明顯增多，多為胞漿及間質黃染，MT干預后表達量較DG組顯著減少(P0.01)，詳見表2、圖2 EH。表2  各組大鼠心肌NF-B p65及COX-2免疫組化IOD值比較(略)3  討論    糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌細胞原發性損傷引起廣泛的結構異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病狀態3。其發病涉及的因素較多，近年來主要集中于心肌細胞的代謝、鈣轉運以及自由基的異常等，其中氧化應激為一重要的始動因素，并貫穿疾病的全過程4-5。本實驗研究結果亦表明，2型糖尿病由于胰島素抵抗(IR)的存在以及由此引起的循環

21、FFA水平增高，可以造成活性氧產生增多，心肌能量底物的代謝改變，表現為糖尿病大鼠心肌MDA升高、SOD水平降低，AOR比值較對照組降低(P0.01)，提示心肌脂質過氧化作用的增強及抗氧化酶活性的降低從而導致心肌細胞受損，至病程12周時已能明顯的觀察到心肌結構的紊亂、線粒體損傷、粗面內質網擴張及心肌間質纖維增生、微血管內皮細胞腫脹、管腔狹窄、基底膜節段性增厚等表現。    雙胍類藥物自從應用于臨床40年來，幾經起伏，1998年公布的英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS)結果表明6，磺脲類和胰島素強化治療心血管事件減少了6.4%，而MT則可減少心血管事件43%，因此MT在

22、治療2型糖尿病的一線用藥地位迅速得以確立。本實驗成功建立2型糖尿病動物模型，應用MT干預12周，觀察到大劑量MT有降低血糖的作用，但與對照組比較仍有統計學意義(P0.01)，而降TG及FFA的作用明顯(P0.05)，且這種作用不刺激胰島素的過度分泌，不引起體重的增加，最終使MDA降低，SOD有所提高，考慮MT具有不依賴于降糖的降低TG及FFA的作用，可調節糖尿病脂質代謝紊亂，降低脂質過氧化產物并提高機體抗氧化酶活力，糾正全身過氧化狀態，與Bailey等的研究結果一致7-8，且干預12周后，電鏡觀察可發現肌絲結構較糖尿病組明顯清晰，線粒體腫脹及內質網的擴張明顯減輕，心肌間質纖維減少，微血管基底膜

23、增厚程度減輕，提示MT的抗氧化作用可能參與了其對糖尿病心肌損害的保護機制，且本實驗結果顯示MT的這種作用與劑量有關。    關于二甲雙胍抗氧化方面的作用機制，目前尚不清楚。Pickup等9提出，在2型糖尿病患者中炎癥是IR起源的觸發因素。在炎癥-IR-DM這一病理生理過程中，脂肪細胞的內分泌調節功能障礙具有重要作用，其致病機制復雜，但中心環節可能是通過氧化應激產生活性氧，活化NF-B、蛋白激酶C(PKC)等。越來越多的證據表明10-11，對氧化應激敏感的NF- B的激活可調控其下游COX-2的表達增高和前列腺素PGE2合成增加，在糖尿病心血管并發癥中的作用日益受到

24、重視。本研究發現，DG組心肌NF-B p65及COX-2表達較對照組組明顯增加(P0.01)，而應用二甲雙胍干預治療12周后可見表達量明顯減少；COX作為前列腺素(PG)合成過程中的一個重要限速酶，在炎癥反應中起了重要作用，COX-2可以刺激ROS合成增加，且與自由基形成正反饋；自由基可誘導膜發生脂質過氧化反應，通透性增加，還可攻擊膜蛋白及胞內的酶系統和核酸，促使細胞凋亡，加重心肌細胞的損害12，本研究結果提示：二甲雙胍對糖尿病心肌病變具有保護作用，其機制可能與減弱脂質的過氧化反應，減少NF-B及COX-2的表達，從而對氧化應激有直接和(或)間接的抑制作用有關。  

25、0; 但是，糖尿病心肌病的形成是多種病理生理機制綜合作用的結果，二甲雙胍通過抑制氧化應激反應而減弱ROS-NF-B-COX-2的表達只是其中一方面，其他相關機制還需進一步探索研究。【參考文獻】  1Jenny E.Gunton，Patric J.D.Metformin Rapidly Increases Insulin Receptor Activation in Human Liver and Signals Preferentially through Insulin-Receptor Substrate-2J.Clin Endocrinol Metab，2003，88(3)：1

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