1、    骨肉瘤抑癌基因表達(dá)及其增殖活性的臨床意義李聯(lián)忠王亦進(jìn)劉亞李忠玉 【摘要】目的檢測(cè)p16、p53基因蛋白及增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在骨肉瘤中的存在情況，探討其與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系。方法采用改良的免疫組化ABC法，對(duì)32例骨肉瘤手術(shù)標(biāo)本和15例正常骨組織標(biāo)本進(jìn)行p16、 p53基因蛋白、PCNA的檢測(cè)。結(jié)果p16、p53基因蛋白、PCNA的陽(yáng)性表達(dá)分別為 37.5%、75.0%、100%，與正常對(duì)照差異有顯著性（P< 0.05，P< 0.01)； p53、p16基因蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與患者的預(yù)后有關(guān)（P< 0.05)。結(jié)論p

2、16、p53基因蛋白、PCNA參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程并與骨肉瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)；p16、p53基因蛋白作為骨肉瘤的預(yù)后指標(biāo)對(duì)判斷骨肉瘤患者的預(yù)后可能更有臨床意義。 【關(guān)鍵詞】骨肉瘤; 基因，抑制，腫瘤; 基因表達(dá); 免疫組織化學(xué)； 預(yù)后 【中圖分類(lèi)號(hào)】R738.1； R392.3 Clinical significance of expression of tumor suppressor genes and proliferative activity in osteosarcoma Li Lianzhong, Wang Yijin, Liu Ya, Li Zhongyu (Departm

3、ent of Orthopaedics, Affiliated Hospital of Weifang Medical College, Weifang ,Shandong 261031) 【Abstract 】ObjectiveTo detect p16, p53 protein and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in osteosarcoma and study their relationship with pathogenesis,development and prognosis of osteosarcoma. Method

4、sThe modified immunohistochemical ABC technique was used to detect the expression of p16, p53 and PCNA in 32 osteosarcoma specimens and 15 normal bone tissues. ResultsThe positive expression rates of p16, p53 genes and PCNA were 37.5%,75.0% and 100% respectively,which were significantly different fr

5、om that in normal tissues (P< 0.05,P< 0.01). There were obvious relationships between the positive expression of p16,p53 and patients prognosis(P< 0.05). Conclusionp16 and p53 protein and PCNA participate in the proliferation processes of osteosarcoma cells and correlate with prognosis and

6、development of osteosarcoma. p16 and p53 as an index of prognosis for osteosarcoma may be of clinical significance to assess the patients prognosis. 【Key words】osteosarcoma; genes, suppressor,tumor; gene expression; immunohistochemistry; prognosis p16及野生型p53基因是腫瘤的抑制基因，當(dāng)發(fā)生缺失或突變后可使腫瘤細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)，是腫瘤增生異常活躍的

7、因素之一。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)較為客觀的指標(biāo)。我們采用改良的免疫組化ABC法，同步檢測(cè)了骨肉瘤中p16、p53基因蛋白及PCNA的表達(dá)情況，并探討了它們?cè)诠侨饬霭l(fā)生發(fā)展中的作用及對(duì)預(yù)后的影響。 1材料與方法 1.1材料32例骨肉瘤免疫組化分析標(biāo)本，取自病理存檔的骨肉瘤組織蠟塊。標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)3.3 mol.L-1中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚 5 m，充分烤片。不加一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性反應(yīng)片作陽(yáng)性對(duì)照。 1.2試劑鼠抗人 p53單克隆抗體、兔抗人多克隆抗體p16（c-20）系美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，單克隆抗體鼠抗PCNA（pc10）、 ABC試劑

8、盒為美國(guó)ZYMED公司產(chǎn)品。以上試劑均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。 1.3方法采用免疫組化ABC法，略加改良，對(duì)切片微波處理代替胰酶消化。工作流程如下：石蠟切片，二甲苯脫蠟20 min，無(wú)水乙醇固定20 min，枸櫞酸鈉工作液在微波爐內(nèi)暴露修復(fù)抗原20 min，乙醇梯度脫水，3% H2O2封閉30 min，5%羊血清封閉1 h，加一抗（p16工作濃度 150， p53、 PCNA工作濃度分別為1150，1200） 37過(guò)夜，加二抗37 1 h，加入工作液A和B（AB1200），6% DAB 37顯色10 min，蘇木素復(fù)染2 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。 1.4結(jié)果判定細(xì)胞核

9、和（或）漿呈明顯棕色反應(yīng)即為陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比進(jìn)行結(jié)果判斷。 1.5統(tǒng)計(jì)方法檢驗(yàn)用四格表資料2檢驗(yàn)或確切概率法。 2結(jié)果 2.1抑癌基因蛋白及PCNA表達(dá)骨肉瘤中 p53陽(yáng)性顆粒主要定位于細(xì)胞核內(nèi)（圖1），陽(yáng)性表達(dá)率為75.0%； p16陽(yáng)性細(xì)胞在組織間散在分布，陽(yáng)性顆粒主要位于胞漿，部分位于胞核中（圖2），其陽(yáng)性率為37.5%；PCNA陽(yáng)性顆粒位于胞核中（圖3）， PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率100%，與正常骨組織對(duì)照差異有顯著性（P< 0.05，P< 0.01)。詳見(jiàn)表1。 圖1p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)ABC法×400 圖2骨肉瘤p16陽(yáng)性表達(dá)ABC法&#

10、215;200 圖3骨肉瘤PCNA陽(yáng)性表達(dá)ABC法×200 表1腫瘤基因蛋白及PCNA表達(dá) 項(xiàng)別 陽(yáng)性率(%) P值 骨肉瘤 (n=32) 正常骨組織 (n=15) p53 75.0 0 < 0.01 PCNA 100 7.7 < 0.01 p16 37.5 66.2 < 0.05 2.2p53、p16、PCNA與預(yù)后的關(guān)系p16、p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后有意義，提示p16、 p53作為骨肉瘤的預(yù)后指標(biāo)對(duì)判斷骨肉瘤患者的預(yù)后可能更有臨床意義。詳見(jiàn)表2。 表2p53、p16、PCNA與預(yù)后的關(guān)系 項(xiàng)別 n* 陽(yáng)性率(%) P值 生存期>3年 生存期<

11、 1年 p53 17 56.3 100 < 0.05 PCNA 24 100 100 >0.05 p16 8 50 0 < 0.05 *指陽(yáng)性細(xì)胞在10%以上的隨訪患者 3討論 PCNA是一種僅在增殖的細(xì)胞中合成與表達(dá)的核蛋白，存在于細(xì)胞周期G1晚期和S期，在促使細(xì)胞DNA復(fù)制活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要標(biāo)志1。本研究中發(fā)現(xiàn)骨肉瘤PCNA陽(yáng)性細(xì)胞檢出率達(dá)100%，明顯高于正常骨組織，說(shuō)明骨肉瘤細(xì)胞增殖活躍、惡性程度高的生物學(xué)特征。雖然其陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)存活時(shí)間影響不大，但亦發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性強(qiáng)度隨生存時(shí)間的延長(zhǎng)而有逐漸減弱的趨勢(shì)，與Mayer等2的觀點(diǎn)一致，即PCNA陽(yáng)性

12、細(xì)胞數(shù)僅僅表明當(dāng)時(shí)腫瘤細(xì)胞的增殖程度，而腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后可能與其他因素有關(guān)，如腫瘤細(xì)胞粘附因子等。 p53屬抑癌基因， p53蛋白的主要生物學(xué)功能為引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡和促進(jìn)分化，有大約50%的人類(lèi)腫瘤，包括肝癌、胃癌、骨肉瘤等都有較高的 p53基因缺失率。研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)正常 p53基因的丟失或 p53基因的突變是導(dǎo)致這些細(xì)胞出現(xiàn)癌變的重要原因，其突變型與腫瘤生長(zhǎng)明顯相關(guān)3，4。本研究結(jié)果表明骨肉瘤p53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)為75.0%，說(shuō)明大多數(shù)骨肉瘤有該基因突變，提示p53基因在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。 p16基因又稱(chēng)多腫瘤抑制基因(MTS1)，其編碼產(chǎn)物p16蛋白是細(xì)胞周期依賴(lài)

13、激酶（CDK）的抑制劑Q，定位于染色體9p21。編碼分子量為16 ku的 p16蛋白，能與cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4，并使之滅活，阻止細(xì)胞周期從G1向S期過(guò)渡，從而負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期5。本研究顯示骨肉瘤中p16陽(yáng)性表達(dá)僅為37.5%，與正常組織相比有顯著差異，說(shuō)明p16基因的失活與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。從理論上推測(cè)p16基因失活可導(dǎo)致p16蛋白表達(dá)缺如，使抑制腫瘤增生的能力降低，影響患者的預(yù)后，本組隨訪資料支持此觀點(diǎn)。然而在不同腫瘤中也有與此相反的報(bào)道6，可能與 p16蛋白的變異有關(guān)。 本研究表明：p53基因的突變和p16基因的失活在骨肉瘤中有較高的發(fā)生率，影響患者的預(yù)后，結(jié)合P

14、CNA的檢測(cè)，能夠較準(zhǔn)確地反映骨肉瘤的分化、惡性程度及進(jìn)展情況，可作為骨肉瘤患者預(yù)后綜合判斷的生物學(xué)客觀指標(biāo)。 作者簡(jiǎn)介：李聯(lián)忠，男，36歲，主治醫(yī)師。研究方向：骨腫瘤，骨關(guān)節(jié)病 作者單位：濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，山東濰坊261031 參考文獻(xiàn) 1王臻，梁戈，黃耀天，等. 骨肉瘤p53、C-erbB-2、C-myc的表達(dá)及預(yù)后的關(guān)系. 中華骨科雜志，1995;15(9)：600603 2Mayer A, Takimoto M, Fritz E, et al. The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen, e

15、pidermal growth factor receptor and mdr gene expression in colorectal cancer. Cancer, 1993;71（8）:2 4542 456 3Barrett JC, Anderson M. Molecular mechanisms of carcinogenesis in human and rodents. Mol Carcinog, 1993;7（1）:113 4Straus BS.The origin of point mutations in human cells. Cancer Res, 1992;52（6）