1、Agilent 1200 LC現場培訓教材安捷倫科技有限公司生命科學與化學分析儀器部培訓目的: 基本了解1200LC硬件操作。 掌握化學工作站的開機，關機，參數設定，學會數據采集，數據分析的 基本操作。培訓準備:1、儀器設備：Agile nt 1200LC G1310A:（單元泵）；G1312A G1312BXL（二元泵）；G1311A（四元泵） G1329A （標準型自動進樣器）。 G1316A,G1316B XL （柱溫箱）。 G1314B,G1314C XL （VW檢測器）。 G1362A （示差檢測器）。 G1315B ,G1315C XL （DAD 檢測器）。 G1365B ,G13

2、65C XL （MWD 檢測器）。 G1321A （FLD 檢測器）。 色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C18 150 x 4.6 mm, 5um columnP/N 993967-902 /5063-66002、溶劑準備： 色譜級純或優級純乙腈或甲醇。 二次蒸餾水基本操作步驟：（一）、開機：1、打開計算機,進入Windows 2000 （或Windows XP 畫面。（IP地址由Bootp Service程序寫入）2 、打開1200 LC各模塊電源。3 、待各模塊自檢完成后，雙擊 “hstrument 1 Online ”圖標，化學工作站自動 與1200LCS訊，進入的工作站畫

3、面 如下所示。4、 從 View”菜單中選擇 Method and Run control ”畫面,點擊”View”菜單中的 Show Top Toolbar ”， Show status toolbar ”， System diagram ”，”Samplingdiagram ”，使其命令前有 標志，來調用所需的界面。5、把流動相放入溶劑瓶中。6、打開Purge”閥。7、點擊Pump圖標，點擊Setup pump”選項，進入泵編輯畫面。8 、設Flow: 3-5ml/min，點擊 OK'。9、點擊“ Pump ”圖標，點擊Pump control ”選項，選中On”，點擊OK，貝U系

4、 統開始Purge，直到管線內（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換通道繼續Purge， 直到所有要用通道無氣泡為止。10、 點擊Pump圖標，點擊PumpControl ”選項，選中Off”，點擊Ok'關泵，關 閉 Purge valve 。11、點擊 Pump圖標，點擊 Setup pump”選項，設Flow: 1.5ml/min 。12、 點擊泵下面的瓶圖標，如下圖所示（以四元泵為例），輸入溶劑的實際體積 和瓶體積。也可輸入停泵的體積。點擊Ok”（二）數據采集方法編輯:1、開始編輯完整方法: 從Method”菜單中選擇Edit entire method”項，如上圖所示選中除Dat

5、aanalysis ”外的三項，點擊Ok”，進入下一畫面。一 *2、方法信息： 在 Method CommentS中寫入方法的信息（如：This is for test!）。 點擊Ok”進入下一畫面。3、泵參數設定：（以四元泵為例） 在 Flow ”處輸入流量,如1.5ml/min ，在 Solve nt B”處輸入 70,（A=100-B-C-D）,也可 Insert 一行”Timetable ” ,編輯梯度。在 Pressure Limits MaX'處輸入柱子的最大耐高壓，以保護柱子。點擊Ok”進入下一畫面Av尸1T " 七rfba4、自動進樣器參數設定:（以標準型G1

6、329A為例） 選擇合適的進樣方式，如圖所示，進樣體積1.0ul ,洗瓶位置為6號。 Standard Injection ”-只能輸入進樣體積，此方式無洗針功能。“hjection with Needle Wash”-可以輸入進樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針。Use injector program”-可以點擊Edit ”鍵進行進樣程序編輯。 點擊Ok”進入下一畫面。""u Vl_|T-iuca一 *一 *5、柱溫箱參數設定:G1316A :在”Temperature ”下面的空白方框內輸入所需溫度，并選中它，點擊”more>>&

7、#39;鍵，如圖所示,選中”Same as left ”-使柱溫箱的溫 度左右一致。UP 一 *G1316B：在”Temperature ”下面的空白方框內輸入所需溫度或與檢測池一致,并 選中它，點擊”more>>”鍵,如圖所示,選中”Same as left ”-使柱溫箱的溫度左右£ ¥一三一、=言一致或與檢測池一致- -cog-!-K.=,lrvi-!-K.=,lrvi 點擊Ok”進入下一畫面。6、VW檢測器參數設定:G1314B: 在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長，如254nm, 在”Peak width (Response tim

8、e) ”下方點擊下拉式箭頭，選擇合適的響應時間，如 >0.1min (2s)。最快采樣速率 13.74HZ。G1314C:在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測 波長,如254nm,在”Peak width (Response time) ”下方點 擊下拉式箭頭，選擇合適 的響應時間，如0.1min (2s)。最快采樣速率55H乙4E AfUr 護! imlM IT< Ri«b Jee£上鼻7 ak 心 b.：|-4 Y =二-J.:41 - J- _ . W.、一2 - .7 I I#. HL.-!-K.=,lrvi-!-K.=,lrvi 在Ti

9、metable中可以“hsert ”一行，輸入隨時間切換的波長，如1min 波長=300nm點擊ok”進入下一畫面。7、DA檢測器參數設定G1315B: 檢測波長：254nm,BW=4nm,參比波長=360nm,BW=100nm;dliZlL-!-K.=,lrvi檢測波長：一般選擇最大吸收處的波長。樣品帶寬BW 般選擇最大吸收值一半處的整個寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區 域。參比帶寬BW至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下用100 nn作為缺省值。Peak width (Responsetime):其值盡可能接近要測的窄峰峰寬。Slit -狹縫窄,光 譜分辨率高；寬

10、時，噪音低。同時可以輸入采集光譜方式，步長，范圍，閾值。選 中所用的燈。G1315C XL:可以開啟光學單元溫 度控制;可以設定8通道信號等 點擊Ok”進入下一畫面8、RID檢測器參數設定:T >* 色譜條件：進樣體積：20ul ; 流速：1.5ml/min;光學單元溫度：35 C ;柱箱溫度：25 C ;極性：正；峰寬（響應時間）：4s 。 如圖所示：Optical Unit Temperature ”-若環境溫度控制在土2°C,設定為Off,若環境溫度不穩定,則設定光學單元溫度為高于環境溫度5度,以防樣品在池中沉淀。Peak width ”-大多數分析設為4S,只有在高速分

11、析下 設為更短。Automatic recycling after analysis”- 在不進行分析時可以讓流動相循環，節省流動相，檢測器連續運行，可隨時投入使用。 * 點擊RID圖標，選擇RID Control “： Heater設為Or”，若要循環流 動相，必須將Recycli ng Valve ”設為ON。手動purge參比池，將其設為Or”，并 輸入Purge時間。9、FLD檢測器參數設定色譜條件： 樣品：P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為1:10。 ODS Hypersial colum n 125mmx4.0mmlDX5u.流動相：A:Water 35% B:乙睛 65

12、% 進樣體積：5ul; 柱溫箱：30 C ; EX=246nm, EM=317nm ;PMT=10 響應時間=4s. 停止時間：4min。 Excitation A:激發波長:200-700nm,步長為 1nm,或Zero Order 。 Emission:發射波長：280-900nm, 步長為 1nm或Zero Order。 PMT多數應用適當的設定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭，則減少PMT值。 Peak width ”：大多數應用設為4s，只有快速分析采用小的設定值。 Multi Ex :多波長及光譜（激發）。 Multi Em :多波長及光譜（發射）。 同時可以輸入范圍Range步長

13、step、采集光譜。10、在 “Run time checklist ”中選中 Data acquisition ”，點擊 Ok”。11、點擊 Method”菜單，選中Save method as”，輸入一方法名，如fest ”, 點擊Ok”。12、從菜單 View”中選中”Online signal”，選中Windows 1,然后點擊Change”鈕，將所要繪圖的信號移到右邊的框中，點擊Ok”.（如 同時檢測二個信號，則重復12,選中Windows 2）。13、從Run control”菜單中選擇Sample info ”選項，如下圖所示,輸入操 作者名稱，如zzz ；在Data file

14、”中選擇 Manual”或Prefix區別:Manual-每次做樣之前必須給出新名字，否則儀器會將上次的數據覆蓋掉。Prefix -在Prefix框中輸入前綴，在Counter框中輸 入計數器的 起始位，儀器會自動 命名，如vwdOOOl, vwd0002。14、 點擊ok”，從Instrument ”菜單選擇 System on ”，或依次點擊圖 標開啟各模塊。15、 等儀器Ready ,基線平穩，從Run Co ntrol ”菜單中選擇Run method”，進樣。（若無自動進樣器，則基線平穩后，進樣 并搬動 手動進樣閥，啟動運行。）（DAD, VW色譜圖如下所示：（三八 數據分析方法編輯

15、:1、 從View”菜單中，點擊Data analysis”進入數據分析畫面。2、 從File ”菜單選擇Load signal ” 選中您的數據文件名, 如下圖所示。點擊Ok；則數據被調出。3、做譜圖優化：從Graphics ”菜單中選擇Signal options ”選項，如下圖 所示。從Ranges”中選擇Full ”或Auto scale ”及合適的顯示時間或 選擇”Use Ranges”調整。反復進行，直到圖的比例合適為止。點擊6k”4、積分: 從integration ”菜單中選擇Integration Events”選項，如下圖所示。選擇合適的 Slope sensitivity

16、 ”， Peak width ”, Area reject ”， Height reject ”。從Integration ”菜單中選擇Integrate ”選項，則數據被積分。如積分結果不理想，則修改相應的積分參數，直到滿意為止。 點擊左邊V”圖標，將積分參數存入方法。5、打印報告: 從Report ”菜單中選擇Specify report”選項，進入如下圖所示畫面。點擊 Quantitative Results ”框中Calculate ”右側的黑三角，選中 Perce nt ”（面積百分比），其它選項不變。點擊Ok”。 從Report ”菜單中選擇Print report ”，則報告結果

17、將打印到屏幕上，如 想輸出到打印機上，則點擊Report ”底部的Print ”鈕。（四） 、關機: 關機前，先關燈，用相應的溶劑充分沖洗系統 。 退出化學工作站，依提示關泵，及其它窗口，關閉計算機（用shut down 關）。 關閉Agile nt 1200各模塊電源開關。（ 五 ） 、Agilent 1200 LC 維護保 養： 色譜柱 長時間不 用，存放時，柱內應充滿溶劑，兩端封死（乙睛/ 甲醇適 于反相色譜柱， 正相色譜柱 用相應的有機相）。 手動進樣器，當使用緩沖溶液時，要用水沖洗進樣口。 流動相使用前 必須過濾，不要使用 多日存放的蒸餾水（ 易長菌）。*帶seal-wash的120

18、0，要配制90%水+10%異丙醇，開啟seal-wash清洗泵, 溶劑 不能干涸。 注意事項及本手冊未包括的儀器見說明書，或由現場工程師介紹。* 注意 ：3 本教材 僅適用于 現場工程師 培訓講解參考之用 ， 內容為工 作站現場培訓的一 般要求 ，請根據用戶 的儀器 配置及 現場用戶的需求進行相應 的培訓 內容增刪 。安捷倫公司 對本教材 可能存在 的錯誤及其后果 不承擔任何 法律責任 ，我們適時推出新版 本的培 訓教材， 恕不另行通知 。維護知識問答1 為什么 溶劑和樣品要過濾 ? 溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、 儀器起到保護 作用，消除由于污染 對分析結果的影響。色譜柱 ：由于填料

19、顆粒很細 ，色譜柱 內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜 柱和毛細管容易堵塞。儀器： 溶劑和 樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內 的藍寶石活塞桿 和 活塞的磨損 。2 為什么HPL（用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？HPLC 用緩沖鹽時, 由于泵頭內的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現象,析出的細小鹽粒 非常堅硬,它附著在藍寶石活塞桿 上,隨著藍寶石活塞桿 的往復運動,容易產生劃痕, 并磨損密圭寸墊,造成漏液等故障現象。在線Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的 緩沖鹽結晶。緩沖鹽的濃度在O.lmol或大于O.lmol時，必須使用該在線沖洗選項. 清洗液配制:

20、 90% 水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力，不 能 干涸 。3 為什么 Agilent 12OOLC 的流動相管路非常細 ?在使用HPL（時,應特別注意”柱外效應”對分析結果的影響，由于樣品分子在液體 流動相中的擴散系數比在氣體中 小45個數量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2 個數量級。因此，樣品進入色譜柱后， 在柱子以外的任何死體積（進樣器、柱 接頭、 連接管、檢測器） 中，樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效 降低 。為使柱外效應減之最小，獲得理想的分析結果， Agilent 12OOLC 使用加工 工藝難度高的毛細管線作為流動相管路。毛細管線

21、 分類：0.17mn內徑 綠色；0.12mm內徑 紅色。PEEK 管線：內徑 O.13mm;O.18mm;O.25mm;O.5mm 。毛細管線優點 : 柔韌 性好.*Agilent 公司同時備有1 /1 6in 的粗外徑毛細管線,適用于不同習慣的用戶 , 優 點是剛性好,但柔韌性差一些。4 流動相使用 前為什么要 脫氣 ？流動相使用前必須進行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如02,以防 止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產生氣泡。氣 泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。 溶解的 氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發生降解而改變柱的分離性能。若用FL

22、D,可能會造成熒光猝滅 。 常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續吹氦脫氣，效果較好， 但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發污染。 抽真空脫氣 法：易抽走有機相。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中， 用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：Agilent1200LC真空脫機利用膜滲透技術，在線脫氣，智能 控制，無需額外操作，成本 低，脫氣效果明顯優于以上幾種方法，并適用于多 元溶劑體系 。5、如何防止溶劑瓶內溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理 ？ 溶劑的質量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器， 從而影響泵的運 行，尤其水

23、溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=47）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶 內溶劑過濾器的堵塞。A:請嚴格執行溶劑過濾。B:請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C:如果應用許可，可在溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉.D:在溶劑瓶內溶劑的上方小流量連續吹氬氣，以隔絕空氣。E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或 磷酸鹽緩沖液。6 Agilent 1200LC 泵如何維護 ？Agile nt 1200LC泵給色譜柱提供穩定、無脈動、流量準確的流動相，及時合理 的 維護非常 重要。A:流動相使用前請必須脫氣、過濾。B：使用緩沖鹽時，要加在線Seal-wash選項。C:關機前，用相應的溶劑充分沖洗系統。D:及時更換Purge Valve內的過濾芯。（當打開Purge Valve時，壓力高于10bar， 表明過濾芯已堵）。E :使用合適的密圭寸圈。7 如何選 擇合 適的泵 頭活塞密封圈 ？泵頭活塞的標準密封圈能適合于大多數應用，但使用正相溶