1、    大鼠大腦中動脈缺血和再灌注后環氧 合酶-2 mRNA表達的研究        摘要目的研究大鼠大腦中動脈缺血和再灌注模型中環氧合酶-2(COX-2)基因的表達。方法原位雜交方法。結果缺血30min再灌注組，血流再通4h后缺血區的大腦皮層有很強的表達并持續24h。缺血90min再灌注組和持續缺血組在缺血區以外的廣泛大腦皮層顯著表達，在海馬的齒狀回兩側及紋狀體也發現表達。COX-2 mRNA的表達可被MK-801抑制。而NBQX和倍他米松對其表達沒有影

2、響。結論在缺血區、缺血周邊部、缺血遠隔區有NMDA受體介導的COX-2表達，闡明上述區域花生四烯酸代謝活性化。關鍵詞環氧合酶-2花生四烯酸局灶性腦缺血原位雜交大鼠 Induction of cyclooxygenase-2 mRNA following transient and permanent middle cerebral artery occlusion in ratLuo Yinan,Huang Haiyan,Fang Xiaoxuan,et al.Department of Neurosurgery,The First Teaching Hospital of Norman Be

3、thune University of Medical Sciences,Changchun 130021AbstractObjectiveExpression profile of COX-2 mRNA following transient and permanent middle cerebral artery (MCA) occlusion in rat. MethodUsing in situ hybridization techniqne. ResultsCOX-2 mRNA was induced prominently in the ischemic cortex at 4h

4、after 30min of transient occlusion and persistent induction was observed until 24h of reperfusion period. 90min of transient MCA occlusion and permanent occlusion induced COX-2 mRNA in the widespread region of the medial striatum,the bilateral hippocampal and the cerebral cortex,except the ischemic

5、region. COX-2 mRNA induction at 4h of MCA occlusion was attenuated by administration of MK-801,but was not influenced by either NBQX or betamethasone. ConclusionsThese data suggest that COX-2 is induced in the surrounding and remote area of ischemic region as well as in the ischemic region by activa

6、tion of NMDA receptor,consequently accelerae metabolism of arachidonic acid metabolism in these regions.Key wordsCysclooxygenase-2Arachidonic acidFocal cerebral ischemiaIn situ hybridizationRat腦缺血時細胞內的Ca2+增多，激活磷脂酶A和C，導致膜磷脂水解，釋放出大量花生四烯酸1，后者被環氧合酶(cyclooxygenase,COX)降解后釋放出TXA2和產生自由基，這些物質均可加速缺血后細胞損傷2。有報

7、告大腦中動脈(MCA)缺血模型大腦皮層也產生COX-2 mRNA表達3，4。COX-2 mRNA表達和腦缺血時間相關性的研究尚無詳細報告。本研究觀察大鼠MCA缺血/再灌注及持續缺血時，COX-2 mRNA表達以及谷氨酰胺酸受體和倍他米松對COX-2 mRNA表達的影響。1材料與方法大鼠大腦中動脈閉塞模型:雄性SD大鼠，體重280g 300g ， 由日本東北大學提供。 在0.5%2%氟烷、NO2和O2混合氣體麻醉下用頭端圓形4-0尼龍手術線，由頸外動脈經頸內動脈插至大腦前動脈制成5。手術中使直腸溫度維持在37。再灌注組：缺血30min或90min后血流再通4、8、24h。持續缺血組：缺血2、4、

8、8、24h。藥物治療組：將MK-801(4mg/kg)和NBQX(90mg/kg)在手術30min前、倍他米松(4mg/kg)在手術3h前腹腔內給藥，MCA缺血4h。空白對照組:實施手術而未栓塞。每組各5只。深麻醉下斷頭摘出腦組織并冷凍，制成厚約20m的冠狀面冰凍切片。采用缺口平移法用35SdATP標識寡核苷酸探針后，在42下進行孵育雜交18h，沖洗切片后，用Kodak XAR-5膠片，經3周放置進行放射自顯影。2.結果2.1  COX-2mRNA的表達   COX-2mRNA在空白對照級廣泛的大腦皮層的淺層及海馬齒狀、CA1CA3區表達(見13)。MCA缺血30min，缺

9、血區的COX-2mRNA減少，但再灌注組4h后的缺血領域的大腦皮層有很強的表達，持續8h、24h。其它部位未發現表達（見1）。缺血90min再灌注組在缺血區的大腦皮層沒有COX-2mRNA表達，但在缺血區以外的廣泛大腦皮層顯著表達，在雙側海馬的齒狀回及紋狀體也有COX-2mRNA表達（見2）。1MCA 30min再灌注組COX-2 mRNA的表達2MCA 90min再灌注組COX-2 mRNA的表達持續缺血組發現在缺血區以外的大腦皮層有顯著的表達。在雙側海馬的齒狀回及CA1CA3區有明顯表達，紋狀體區與缺血90min再灌注組相比有明顯的表達(見3)。3MCA持續缺血組COX-2 mRNA的表達

10、2.2谷氨酰胺酸受體激動劑及倍他米松對COX-2 mRNA表達的影響NBQX和倍他米松投藥組對大腦皮層海馬紋狀體的COX-2 mRNA表達水平無有意義的影響，但發現MK-801投藥組各區域的COX-2 mRNA的表達被明顯抑制(見4)。4投藥組COX-2 mRNA的表達3討論我們對缺血30min再灌注組、缺血90min再灌注組、持續缺血組及投藥組4個不同缺血負荷的COX-2 mRNA的表達加以研究，在MCA缺血30min時，只表達紋狀體外側梗塞，而大腦皮質未發現梗塞。缺血30min再灌注組，在一度表達減少的缺血區的大腦皮層，從再灌注4h起，COX-2 mRNA的表達明顯增加，這考慮局部沒有形成

11、梗塞，細胞修復機能尚沒有發生不可逆損傷，同時隨著血流再通，提供了修復所必須的氧和能量，此外COX-2 mRNA基因可在血流再通24h后持續的表達。在缺血90min再灌注組及持續缺血組，缺血區的大腦皮層未發現COX-2 mRNA的表達，但缺血區周圍大腦皮層及雙側海馬的齒狀回有顯著的表達。這不同于30min再灌注組。隨缺血時間的延長，缺血區的組織可發生不可逆損傷，細胞功能喪失。非缺血區由于受在缺血早期從缺血區釋放出大量花生四烯酸的刺激，引起大腦皮層反復去極化，其結果使神經興奮由大腦皮層擴散到雙側海馬齒狀回及CA3CA1區6。在海馬CA3CA1區COX-2 mRNA的表達僅表現在持續缺血組，說明此部

12、位的表達需90min以上缺血刺激。30min再灌注組的非缺血區未發現COX-2 mRNA的表達，與90min再灌注組有差異性，可能是30min缺血時間不能形成對非缺血區閾上刺激所至。在紋狀體COX-2 mRNA的表達僅表現在缺血90min再灌注組及持續缺血組。在缺血30min再灌注組未發現COX-2 mRNA的表達，這可能是在大鼠大腦中動脈閉塞模型中紋狀體為不完全缺血區，這些部位的COX-2 mRNA表達對缺血時間有依賴性。在本實驗中，我們發現不論是持續缺血組還是再灌注組COX-2 mRNA的表達都持續24h，與Nogawa等4的報告相符。COX-2 mRNA的持續表達機制是我們今后研究的關鍵

13、。在投藥組，NBQX不能抑制COX-2 mRNA的表達，而MK-801對COX-2 mRNA的表達有明顯抑制作用。Yamagata等7在大鼠癲癇實驗中發現大腦皮層的COX-2 mRNA的表達同樣被MK-801所抑制，說明COX-2 mRNA的表達是由于NMDA受體的介入引起神經興奮性增高所致。另一方面，由于倍他米松可阻止前列腺素A2生成使花生四烯酸的代謝降低，Kujubu等8報告倍他米松抑制末梢組織的COX-2 mRNA表達，還有在大鼠癲癇實驗時對大腦皮質的COX-2 mRNA表達有抑制作用7。但在本研究中，倍他米松對COX-2 mRNA的表達沒有明顯的影響，和文獻相比有較大的差異，也許有必要

14、給予更多的藥物再進行觀察。由于COX-2 mRNA是花生四烯酸代謝所必需的酶，在COX-2 mRNA表達的上述部位，其代謝產物前列腺素和血栓素等產生增加，提示花生四烯酸代謝亢進。而這些代謝產物有腦血管收縮作用，可加重腦缺血后低灌注損傷，同時和自由基等可損傷血腦屏障引起血管通透性加大,加重缺血性細胞損害。而缺血區域以外COX-2 mRNA的表達可能與神經機能聯系喪失有關，是我們今后研究的關鍵。根據本研究，MCA閉塞后在缺血區、缺血周邊部、缺血遠隔區發現有NMDA受體介導的COX-2表達，在這些部位顯示了花生四烯酸代謝的亢進，而缺血性細胞損害可能與自由基等代謝產物有相關性。作者單位：130021白

15、求恩醫科大學一院神經外科參考文獻1 Bazan NG. Effects of ischemia and electroconvulsive shock on free fatty acid pool in the brain. Biochem Biophys Acta,1970,218:1.2 Ciaudet RJ,Alam I,Levine L. Accumulation of cyclooxygenase products of arachidonic acid metabolisin in gerbil brain during reperfusion after bilateral c

16、ommon carotid artery occlusion. J Neurochem,1980,35:653.3 planas AM,Soriano MA,Rodriguez-Farre E,et al. Induction of cyclooxygenase-2 mRNA and protein following traasient focal ischemia in the rat brain. Neurosci Lett,1995,200:187.4 Nogawa S,Zhang F,Ross ME,et al. Cyclooxygenase-2 gene expression in

17、 neurons contributes to ischemic brain damage. J Neurosci,1997,17:2746.5 Kinouchi H,Sharp FR,Hill MP,et al. Induction of 70-kDa heat shock protein and HSP70 mRNA following transient focal cerebral ischemia in rat. J Cereb Blood Flow Metab,1976,13:105.6 Lauritzen M,Rice ME,Okada Y,et al. Quisqualate and NMDA can initiate spreading depression in the turtle cerebellum. Brain Res,1988,475:317.7 Yamagata K,Andreasson KL,Kaufmann WE,et al. Expression of mitogen-inducible cycl