1、丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究進展                     作者：周友乾，尹鳳鳴 馮經華【關鍵詞】  丙型肝炎 病毒NS5A 蛋白丙型肝炎病毒(HCV)可引起肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝臟疾病，且慢性化幾率較高。目前全世界HCV感染人數仍呈增加趨勢，因此科學家對HCV的研究高度重視。HCV有一個大的開放閱讀框編碼約三千多個氨基酸的多聚蛋白，經蛋白酶裂解為十個多肽片段;

2、氨基末端為結構蛋白包括有核心蛋白、包膜蛋白E1和E2、P7蛋白;羧基末端為非結構蛋白包括有NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。基中NS5A蛋白位于HCV多聚蛋白前體的1973-2419氨基酸區域，由447個氨基酸組成，氨基末端為雙親性螺旋可與內質網膜結合。NS5A還包含有3個同樣的ProXaaXaaPro基序，這些基序存在于許多信號蛋白中形成伸展的螺旋，并與Src同源3(SH3)功能區結合。根據NS5A上絲氨酸殘基磷酸化程度的不同有p56和p58兩種成熟形式。越來越多的科學家推測NS5A蛋白可能在HCV干擾宿主細胞內信號和免疫逃避方面有一定的作用，發表了不少論文。本文就

3、NS5A蛋白功能和作用機制的研究進展作一綜述。1 與病毒復制的關系Lohmann等1最早運用亞基因組復制子系統研究提出NS5A與RNA復制有關。隨后研究進一步發現NS5A的雙親性膜靶標螺旋的變異與復制子有關，導入三個螺旋分裂的突變可完全終止復制子建立G418耐藥的克隆，意味著NS5A的膜結合是HCVRNA復制不可缺少的一步。體外臨時轉染細胞研究顯示NS5A和NS5B結合是由NS5A的105-162和277-334殘基與NS5B上的四個不連續的區域相結合。奇怪的是當他們的比例為0.1或更低時，NS5A可適度刺激NS5B的聚合酶活性，而更高的比例時NS5A抑制NS5B的聚合酶活性。具體機制目前還不

4、清楚，分析認為有可能是體外純化的NS5A和NS5B融合蛋白的作用結果并不能準確地反映他們在體內的情況。Shimakami等刪除NS5A中與NS5B結合的部分導致亞基因組復制子無功能，而如果刪除部分不影響NS5A與NS5B結合則復制子仍能復制，因此推測NS5A與NS5B之間的相互作用是HCV RNA復制所必需的。用人類肝細胞cDNA文庫的酵母雙雜交篩選法研究細胞蛋白與NS5A蛋白的相互作用鑒定出33kD人類囊相關膜蛋白(hVAP-33)。體外連接及體內聯合免疫沉淀作用研究，證實NS5A與hVAP-33之間有相互作用，病毒RNA依賴的RNA聚合酶NS5B也與hVAP-33作用，它倆分別結合到hVA

5、P-33的羧基末端和氨基末端，NS5A和NS5B同時與hVAP獨立作用。免疫熒光顯示，hVAP-33主要與ER、高爾基復合體、以及前溶酶體結合。hVAP可以作為HCV復制復合物的膜受體，介導HCV復制復合物與膜結合，NS5A及NS5B與hVAP-33的相互作用可能會影響宿主細胞的囊泡轉運功能。研究還發現在一些HCV分離株中有一被稱為干擾素敏感決定區(ISDR)內的突變率與病毒RNA滴度成負相關，在人肝細胞內NS5A的表達可活化內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site, IRES)活性，而ISDR突變則破壞IRES活性，這也預示著NS5A蛋白可能在調節HCV復

6、制中起作用。最近Okamoto等發現NS5A在細胞質中與FK506結合蛋白8的相互作用也在HCV復制中發揮重要作用。2 與干擾素抗病毒治療的關系Enomoto等通過分子流行病學調查發現NS5A與干擾素(IFN)治療的療效相關，并鑒定出NS5A中一個約40個氨基酸的序列在IFN耐藥種株中相對保守，而在IFN敏感種株中變異率較高，因此，推測NS5A在IFN耐藥中發揮一定的作用，并把這個氨基酸序列區稱為ISDR。隨后科學家10還發現：表達有IFN耐藥的HCV1b種株的NS5A蛋白的細胞對IFN部分耐藥，并允許腦心肌炎病毒和口腔炎小皰疹病毒生長;而在同樣的實驗中表達IFN敏感的HCV1a或HCV2a基

7、因型或者刪除了ISDR的HCV1b型的NS5A蛋白并不能抑制IFN的活性。Nousbaum等11認為NS5A羧基末端ISDR以外的一段序列也與IFN活性有關。IFN是由宿主不同類型的細胞為應對病毒感染和某些刺激而分泌的細胞因子，分為型和型。型IFN(，)是由各類細胞針對病毒感染分泌的抗病毒活性多肽，表現出非特異性免疫應答特點;型IFN也稱為IFN是由促有絲分裂素或抗原刺激激活的T細胞和巨噬細胞分泌的抗病毒多肽，充當特異性抗原免疫應答的任務。型IFN信號途徑的傳遞始于IFN與特異性細胞表面IFN受體的結合。IFN與細胞膜上受體結合，引起受體二聚體化，受體胞內區的酪氨酸殘基在Janus激酶作用下磷

8、酸化，而后信號傳遞體和轉錄激活劑(STATS)也被Janus激酶磷酸化。兩種Janus激酶酶家族成員JAK1和Tyk2，參與了型IFN信號傳導。磷酸化的STAT1和STAT2結合成異二聚體，轉移到細胞核內與DNA結合蛋白p48結合，形成三聚體的干擾素激活基因因子3(ISGF3)。ISGF3在許多IFN激活基因啟動區與IFN激活順式作用元件(ISRE)結合促進轉錄。除了ISGF3外，不同的STAT和二聚體以及不同的IFN轉錄調節因子，在IFN信號傳遞途徑中也起重要作用。大量IFN激活基因表達，其蛋白產物介導IFN多效性抗病毒作用。目前認為IFN抗RNA病毒的主要機制是其能夠誘導產生的一種dsRN

9、A依賴的蛋白激酶(PKR)，這種PKR在RNA病毒基因復制時與dsRNA結合而激活，激活后能夠磷酸化翻譯啟始因子eIF-2a亞單位的51位絲氨酸殘基，使磷酸化的eIF-2a無法參與蛋白多肽鏈的翻譯過程，從而抑制病毒或細胞蛋白的合成，達到抗病毒的效果12。而研究發現NS5A中ISDR及與其相臨的羧基末端的26個殘基與PKR的一個二聚作用區域結合后能夠抑制PKR自身的磷酸化和對其他外來物質的磷酸化從而抑制PKR活性。不過也有科學家13，14報道未能發現ISDR與IFN療效的關系。Podevin等15雖然證實NS5A能夠抑制IFN抗腦心肌炎病毒和口腔炎小皰疹病毒的活性，但不管是IFN敏感的還是不敏感

10、的NS5A在Huh7或HeLa細胞中都未觀察到對PKR活性的影響，用共免疫沉淀和共免疫熒光方法也未檢測到NS5A和PKR的相互作用。這提示NS5A可能還通過其他機制抑制IFN的抗病毒活性。Khabar等16發現白介素8(IL8)能夠減弱IFN的抗病毒活性，提示內源性的IL8的產生有助于病毒的感染。Polyak等17也發現HCV感染的患者血清中IL8的水平高于對照組，IFN無應答組高于應答組，并提出NS5A能夠促進IL8的產生并減弱IFN的抗病毒活性。隨后Girard等18用芯片分析法觀察到了同樣的現象。Blindenbacher等19發現表達有HCV全基因組的轉基因小鼠IFN刺激轉錄因子ISG

11、F3的DNA結合活性降低，而淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒易感性增加。Shuai等20認為Stats的絲氨酸磷酸化在IFN信號的調節方面起著關鍵性的作用。Macdonald等21推測NS5A可能通過與連接蛋白Grb2相互作用抑制細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)MAPK的活性;這樣，NS5A可降低Stat1絲氨酸的磷酸化并減弱細胞對IFN的反應。然而，他們22隨后發現對IFN敏感和耐藥的HCV不同基因型的NS5A都能與Grb2結合，似乎并不支持這個假說。3 與促進宿主細胞有絲分裂的關系HCV能夠通過調節宿主細胞的有絲分裂信號途

12、徑來調節宿主細胞的生長和活性，從而維持其慢性感染狀態。目前認為主要有三種途徑：ERK途徑、SAPK/JNK途徑和p38MAPK途徑23。他們都是基于一個包含有MAPK的三重激酶信號組件，NS5A能夠調節這三種MAPK信號途徑。NS5A能夠抑制ERK MAPK途徑：體外研究顯示NS5A能夠與Grb2結合。Grb2能夠通過一個SH2區與活化的EGF受體上磷酸化的酪氨酸殘基結合使鳥嘌呤核苷酸交換因子Sos遷移到細胞膜，然后催化Ras GDP-GTP轉換，并激活ERK途徑22。Tan等24報道NS5A并不阻止Grb2-Sos復合體的形成，而后Hanafusa等進一步證實NS5A能與Grb2 SH2區結

13、合抑制Grb2-Sos與生長因子受體結合，并未抑制Grb2-Sos的結合。NS5A能夠活化JNK MAPK信號途徑：NS5A與連接蛋白TRAF2結合，再與配體上的TNF受體結合，參與JNK的活化25。Park等26認為NS5A不是直接活化JNK，僅僅是通過TNF增強其活性。NS5A還可通過與TRAF2相互作用調節JNK的活性，在缺乏TNF時，NS5A也能夠通過足夠表達TRAF2調節JNK的活性。NS5A也能夠抑制EGF刺激的p38MAPK的活性：這條途徑在通過下游靶標控制蛋白翻譯方面起著關鍵性的作用，主要是磷酸化翻譯啟始因子eIF4E和調節其活性。NS5A的表達能夠降低eIF4E的磷酸化27。

14、4 與細胞凋亡的關系NS5A能夠利用多種機制抑制外源性和內源性凋亡刺激因子減少宿主細胞的凋亡。TNF是一種主要的外源性凋亡刺激因子，研究表明28，29表達NS5A蛋白的細胞能夠抵擋TNF的作用，與對照組相比細胞凋亡明顯減少。生物化學分析顯示NS5A與TNF應答連接蛋白TRADD相互作用調節抑制TNF-信號。TRADD與配體上活化的TNF受體結合并形成一個復合體，這個復合體再向多個下游的效應器(胱門蛋白酶、NF-B等)傳達信號;NS5A與TRADD結合能夠阻斷這些信號。內源性的凋亡主要通過促凋亡和抗凋亡信號的平衡來調節，例如Bcl2蛋白家族包含有促凋亡和抗凋亡成分，他們在線粒體和細胞核膜上受Bc

15、l-2相似區域(BH)間相互作用的驅動形成異二聚體。這家族中不同成分之間的平衡指導著凋亡反應30。Chung等31發現Bcl2家族抗凋亡成分的BH區域與ISDR序列具有相似性。NS5A內的BH區域能夠和促凋亡的Bcl2蛋白(Bax)結合促進細胞凋亡，這需要NS5A和Bax都存在于細胞核內;然而，完整的NS5A只存在于細胞質內。目前認為是凋亡細胞中的caspase家族切割了NS5A全長蛋白致使其內部穩含的核定位信號暴露出來，從而使NS5A進入細胞核內發揮功能32。在DNA損傷或不正常復制時p53是一種內源性凋亡信號。Majumder等33發現NS5A在細胞漿中能與p53結合形成復合物，封閉了p5

16、3與其特異DNA序列的結合區域或使p53發生空間構形變化導致結合區域隱蔽起來，抑制p53與DNA序列結合，使p53的反式激活作用減退，從而影響了p53下游基因(p21等)的活化和表達。NS5A還能粘附于內質網膜并介導內質網的應激，產生應激后內質網釋放鈣離子34，后者被線粒體吸收使跨膜電位發生改變，導致線粒體內氧化活性產物(ROS)水平升高，進而介導NF-B和STAT3的激活和核轉位;發揮它們調控基因轉錄的生物效應，抑制p53的功能及其介導的細胞凋亡作用。龔國忠等35也研究證實NS5A能減弱DNA損傷劑誘導的G1期阻滯并阻斷S期停滯，推測這可能使細胞DNA受到損傷時不能得到及時有效的修復，細胞在

17、病理狀態下繼續增殖分化，最后導致細胞功能和表型改變，是HCV致腫瘤病變的細胞分子機制之一。最近Inubushi等36發現NS5A還可能通過抑制Syk激酶的活性而導致宿主肝細胞癌變。         【參考文獻】  1Lohmann V, Korner F, Koch JO, et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell lineJ.Science, 1999, 285110-113.Elazar M,

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