1、四神丸化裁治療潰瘍性結腸炎的對比性實驗研究                      作者：湯菲， 趙海梅 ，潘琦虹 ，劉端勇 ，左志琴【摘要】  目的探討四神丸化裁前后實驗性潰瘍性結腸炎的效果及作用機制異同。方法50只小鼠分成5組：即正常組、模型組、四神丸組、加味四神丸組和陽性對照組，采用傳統的DSS法復制小鼠潰瘍性結腸炎模型，給藥10 d后，觀察其病理組織學變化，

2、并采用流式細胞術檢測其結腸上皮細胞凋亡率，用ELISA測定其外周血PAF及其結腸組織勻漿TNF-，IL-10，TGF-表達水平。結果各治療組結腸指數、結腸損傷評分、病理組織學評分及細胞凋亡率較模型組明顯下降（P0.01或P0.05）。同時四神丸明顯升高TGF-表達水平（P0.05），而對TNF-，IL-10，PAF表達水平作用不明顯。而加味四神丸則可顯著降低TNF-及PAF表達、升高TGF-水平較明顯（P0.01或P0.05），同時，兩治療組之間比較，可見加味四神丸降低TNF-，PAF表達，升高IL-10水平明顯優于四神丸組。結論四神丸和加味四神丸二者均可有效緩解實驗性潰瘍性結腸炎的炎癥損傷，

3、其作用機制的差異性可能在于加味四神丸可以通過抑制血小板活化因子，調節結腸局部促/抗炎因子之間的平衡來實現，而四神丸可能是通過升高TGF-表達水平，促進上皮損傷后修復，潰瘍愈合。 【關鍵詞】  四神丸化裁 潰瘍性結腸炎 療效 機制    潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis, UC)是以直腸、結腸黏膜及黏膜下層的炎癥和潰瘍形成為病理特點的慢性非特異性腸道疾病1。其屬于中醫”泄瀉”“久痢” “腸癖”“滯下”“腸風”“臟毒”等范疇，其病機多認為是以脾腎虧虛為本，以濕熱為標，同時也有很多醫家認為潰瘍性結腸炎反復發作、纏綿難愈，血瘀是UC發病過程中的

4、一個中心環節2。因此治療時常見常用治法和活血化瘀法聯合使用，療效顯著3。盡管兩者都有效，但其作用機制不明。1  材料1.1  動物及分組健康雄性昆明小鼠（南昌大學醫學院實驗動物中心），雄性，1822 g，按體重隨機分為5組，即正常組、模型組、四神丸組、加味四神丸組、柳氮磺吡啶對照組（陽性對照組）每組10只，適應性飼養3 d后用于實驗。1.2  藥物和試劑四神丸：由補骨脂，肉豆蔻，五味子，吳茱萸組成；加味四神丸由四神丸加桃仁、紅花組成，藥物購于江西中醫學院附屬，上藥由江西中醫學院藥劑室制成含藥2 g/ml及4 g/ml浸膏劑，4冰箱保存備用。柳氮磺吡啶每片0.25

5、g（上海三維制藥有限公司生產，批號：002083）；葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國sigma公司，批號：2508-19-2）。TNF-、IFN-、IL-10、TGF-ELISA劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司產品，PAF-ELISA檢測由南京建成生物工程研究所完成。1.3  儀器酶標儀（Thermo Multiskan MK3）；1575型洗板機（BIO-RAD制造）；BIOFUGE28RS型低溫高速離心機（德國HERAEUS制造）；流式細胞儀（美國Coulter公司型號EPICS（XL）。2  方法2.1  造模4并加以改進，采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）灌胃法制作

6、潰瘍性結腸炎（UC）小鼠模型：將5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）0.8 ml灌胃，1次/d，同時自由飲含2% DSS水，連續7 d。2.2  給藥自造模成功次日，按體表面積換算，四神丸組、加味四神丸組分別給予0.2 ml浸膏劑(含生藥濃度分別為： 1 g/ml，2 g/ml)灌胃，陽性對照組予柳氮磺吡啶（SASP）混懸液0.2 ml（含藥75 mg/ml），正常組及模型對照組均予等容量生理鹽水灌胃，1次/d，共10 d。2.3  處理及觀察給藥10 d后，摘眼球取血，脫頸椎處死大鼠，迅速自肛門2 cm處向上分離結腸68 cm，稱重后沿腸系膜縱軸剪開，用生理鹽水沖洗干凈，并將腸黏膜

7、向上平鋪于蠟板上固定，觀察炎癥及潰瘍發生情況；根據炎癥損傷程度進行結腸組織損傷評分。評分標準5：無損傷0分；黏膜充血、水腫、未出現潰瘍為1分；黏膜充血、水腫、輕度糜爛、無潰瘍為2分；黏膜充血、水腫、中度糜爛、有單個潰瘍為3分；黏膜充血、水腫、高度糜爛、有多處潰瘍為4分；黏膜充血、水腫、重度糜爛、有1 cm以上潰瘍為5分。剪取部分結腸組織，10%福爾馬林溶液固定，病理切片，HE染色，光鏡下觀察潰瘍生成情況；部分結腸組織迅速于液氮中保存，待用于檢測細胞凋亡水平和細胞因子的表達。病理組織學評分標準6： 受累區域百分率；濾泡聚集數目；水腫；糜爛潰瘍；隱窩丟失；單核、多核細胞浸潤。 和分為5級：0分正常

8、；1分<10 ；2分10 ；3分10 50 ；4分>50 。糜爛分為4級：0分上皮完整；1分固有層受累；2分潰瘍累及黏膜下層；3分潰瘍透壁。 和 、則分為：0分無；1分輕度；2分中度；3分重度。將上述各項得分相加為病理組織學評分。同時各組各鼠結腸指數，結腸指數（）=結腸重量/體重×100，以考察結腸水腫等炎癥表現。2.4  流式細胞術檢測細胞凋亡水平將凍于液氮中的結腸塊用眼科彎剪刀放在60 m孔徑的尼龍網上剪碎,用PBS沖下，收集成單細胞，細胞用95%乙醇固定，上機前用清洗1次，1 500 r/min離心5 min；棄上清液。加曲通1 ml，室溫下靜置10 mi

9、n，離心1 500 r/min，棄上清液。加PBS清洗1次，棄上清液，加PNASE酶1 ml，37水浴恒溫箱振蕩10 min，1 500 r/min離心；棄上清液，加碘化丙啶(propridium 10 dide)1ml染色，用孔徑60 m的尼龍網過濾后，存放在4冰箱內20 min上機檢測。2.5  酶聯免疫吸附法檢測結腸局部細胞因子水平參照試劑盒的說明書檢測外周血血小板活化因子（platelet activating factor, PAF）表達水平及結腸組織勻漿中TNF-，IL-10，TGF-的含量。使用現成包被好的試劑，向96孔板中分別加入100 l的待測上清液和標準品，室溫下

10、孵育2 h，加入100 l的檢測抗體，室溫下孵育1 h，用緩沖液洗5次，加入100 l的辣根過氧化物酶標記的親合素，室溫下孵育30 min。用洗滌緩沖液洗5次，加入100 l TMB底物，室溫孵育15 min后，加入50 l終止液，用酶標儀于波長450nm測定吸光度值。2.6  統計學方法采用SPSS11.5軟件進行統計學處理，各組數據進行正態檢驗及方差齊性檢驗，采用方差分析。1         3  結果3.1  病觀察及結腸損傷評分見表1。肉眼下可見模型組結腸黏膜明顯充血、水腫，中

11、到重度糜爛和多個潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形，底部干凈，或可見少量淡黃色覆蓋物，邊緣充血水腫；鏡下可見黏膜糜爛脫落、充血水腫，炎癥細胞浸潤，形成多個潰瘍缺損，結腸指數、結腸損傷評分及病理組織學評分明顯高于正常組（P0.01）；各組亦可見少量充血水腫和部分結腸可見輕度糜爛和潰瘍，鏡下可見潰瘍數目明顯減少，底部可見纖維結締組織增生，充血水腫明顯減輕，伴少量炎癥細胞浸潤，與模型組比較結腸指數、結腸損傷評分及病理組織學評分明顯下降并具有統計學意義（P0.05）。同時，四神丸與加味四神丸兩組之間比較無顯著性差異，提示四神丸及加味四神丸均可明顯緩解結腸損傷局部充血水腫，減輕炎癥細胞浸潤程度，減少潰瘍數目，促進

12、結腸上皮損傷修復、潰瘍愈合。表1  結腸黏膜損傷修復情況（略）與正常組比較，P0.01；與模型組比較，P0.01，P0.05；與四神丸組比較,*P0.05；n=103.2  結腸上皮細胞凋亡情況見表1。結腸上皮細胞凋亡水平可見模型組較正常組明顯升高（P0.01），而各治療組與模型組比較，其結腸上皮細胞凋亡率明顯下降（P0.01或P0.05）。同時加味四神丸組與四神丸之間比較，加味四神丸降低結腸上皮細胞凋亡率明顯優于四神丸(P0.05），提示四神丸及加味四神丸均可明顯抑制結腸上皮細胞凋亡速度，減輕損傷程度，且加味四神丸優于四神丸組。3.3  結腸局部細胞因子表達水平

13、見表2。結腸局部組織勻漿細胞因子水平可見，模型組TNF-，PAF表達水平明顯高于正常組（P0.01或P0.05），而IL-10，TGF-表達水平均明顯低于正常組，給藥10 d后，與模型組比較，四神丸組明顯升高TGF-水平外（P0.01），對TNF-，PAF，IL-10表達作用不明顯，或僅有作用趨勢，而無統計學意義。而加味四神丸與模型組比較，降低TNF-，PAF表達、升高TGF-水平較明顯（P0.01或P0.05），同時，四神丸與加味四神丸之間比較，可見加味四神丸降低TNF-，PAF表達，升高IL-10水平明顯優于四神丸組（P0.05），但升高TGF-水平則無統計學意義。4  討論&#

14、160;   潰瘍性結腸炎是一種不明病因的炎癥性結腸疾病。宏觀上，幾乎各種證型都不同程度存在著淤血狀態；微觀上，均有血液流變學的改變7。王長洪提出UC病人不論病史長短、癥狀輕重、緩解或發作，主訴均為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，結腸鏡檢查黏膜充血、水腫，甚至出現糜爛、潰瘍、出血，腸黏膜活檢病理組織學常見大量血栓形成，均與中醫的“血淤”之證吻合，強調UC總的病機特點應歸納為“淤滯”，病理特征是虛中夾實，并貫穿于疾病的全過程8。根據久病成虛和久病成淤的理論，UC日久，其病機以脾腎虧虛為本的病理狀態，同時兼夾淤血凝滯，故而治療上可見溫補脾腎法和活血化淤法聯合使用。如何勝國等3采用溫陽活

15、血法治療非特異性UC患者34例，結果有效率為97.06%，效果顯著。表2  結腸組織勻漿細胞因子的表達（略）與正常組比較，P0.01，P0.01；與模型組比較，P0.01，P0.05；與四神丸組比較,*P0.05；n=10    研究表明，潰瘍性結腸炎患者體內存在血液高凝狀態9，提示高凝狀態的形成可能是UC的重要發病特征之一。潰瘍性結腸炎患者外周血和患病局部均存在血液濃稠性、聚集性、黏滯性增高，血液循環減慢，導致腸黏膜血液灌流減少，細胞缺血、缺氧，進而引起腸黏膜組織損傷7。高凝狀態的形成與PAF（Platelet Activating Factor，PF

16、A）的活化有密切的關系，PAF在潰瘍性結腸炎的發病過程中起關鍵性作用，可潛在性刺激前炎癥因子的產生和增加炎癥細胞10。Ko等11研究發現，PAF與靶細胞表面受體結合后激活核因子NF-B而上調IL-1，TNF-的合成和分泌。IL-1，TNF-作為一級炎癥因子，又刺激多種炎癥細胞合成PAF。PAF還可顯著性促進CD4T細胞增殖，調節T淋巴細胞亞群之間的平衡，趨化T淋巴細胞，且可降低SIgA水平，損害腸黏膜的免疫屏障功能12。CD4T細胞已經被確定作為潰瘍性結腸炎的致病性T細胞，它是通過Th1或Th2通路引發腸道炎癥的13。前者能產生大量的IL-2，IFN-等；后者Th2細胞則可產生IL-4，IL-

17、5等細胞因子，從而活化B細胞，產生中和抗體和IgE。血小板活化因子激活后，釋放或促進大量炎癥因子的分泌，引起血小板的黏附和聚集，或作為炎癥介質，或調節免疫功能，直接或間接參與腸道黏膜的損傷，最終引起UC患者體內血液的高凝狀態的形成，因此，PAF廣泛的參與了潰瘍性結腸炎的多個發病關鍵環節，形成以血小板活化因子為中心，以炎癥介質、免疫異常為，導致高凝狀態，引起結腸局部血管內皮損傷，結腸局部組織細胞缺血缺氧，最終導致結腸黏膜變性壞死，形成潰瘍。    本實驗中，模型組TNF-、PAF表達水平明顯高于正常組，而IL-10、TGF-表達水平均明顯低于正常組，與相關報道較一致

18、。加味四神丸則可顯著降低TNF-、PAF表達、升高TGF-水平較明顯，表明活血理腸丸可能抑制血小板活化因子的活化，進而調節抗炎因子和促炎因子平衡，減輕炎癥損傷，促進黏膜修復、潰瘍愈合。而四神丸則明顯升高TGF-表達水平，表明四神丸可有效治療潰瘍性結腸炎的途徑可能是通過升高TGF-表達水平，由此抑制單核細胞及T細胞等細胞的活性，減少TNF-a等促炎因子的分泌，促進上皮細胞修復，減少上皮細胞凋亡的速度，加速潰瘍愈合。二者均有效治療潰瘍性結腸炎，但二者作用的可能機制不同，臨床使用時宜根據患者血凝狀態程度和辨證論治加以選擇。【】  1郭建鵬.潰瘍性結腸炎的中醫藥治療研究進展J 時珍國醫國藥，

19、2006,17(8):1576.2陸宇平,王長洪. 活血化瘀法在治療潰瘍性結腸炎中的應用J中華中醫藥學刊，2008,5(26):970.3何勝國, 張笑平.溫陽活血法治療非特異性潰瘍性結腸炎34例近遠期療效觀察J.安徽中醫臨床雜志，2001,13(4):262.4張志軍, 劉 懿, 王 磊, 等.TLR4mAb對急性期潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜中促炎因子的影響J. 復旦大學學報（醫學版），2008,35(2):176.5Duan-Yong Liu, Hai-Mei Zhao, Ning Zhao, et al. Pharmacological effects of Ba-Wei-Xi-Lei powder on ulcerative colitis in ra