1、單克隆抗體純化工藝中Protein A層析介質的選擇1. 單抗分離純化中的親和層析介質親和層析具有專一、高效的特性。一般使用親和層析純化后，抗體的純度一般大于95%以上，收率在95%以上；所以在抗體純化工藝中一般使用親和層析作為單抗純化工藝的捕獲步驟。在單抗分離純化中使用的親和層析主要是有： 嵌合抗體，人源化，全抗體一般使用Protein A 或Protein G層析介質為捕獲步驟； b. FC融蛋白一般使用Protein 層析介質做捕獲步驟；c Fab片段，或scFv 單鏈抗體一般使用Protein L層析介質捕獲， Protein L (Capto L) 對輕鏈kappa片段有特異吸附。如

2、果輕鏈的種類是Lambda，可以選擇Lambda Select 特異的捕獲。d 單區域抗體sdAb一般有VH區域，也可以使用protein A，如MabSelect 作為捕獲步驟。1.1 Protein A 的性質金黃色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。能特異性地與人或哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區域結合。天然的protein A SPA是十種氨基酸組成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無二硫鍵。紫外光譜和吸收系數為A275nm %=1.65，等電點為pH5.1。SPA十分穩定，用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、

3、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件，以及加熱煮沸均不影響其活性。分子量：全長的SPA 54KD，去掉與細胞壁結合部分的SPA 42KD。SPA與IgG結合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。近幾年來基因工程的SPA出現，解決了天然protein A的耐堿性問題，MabSelect Sure是基因工程的SPA，去掉了天然SPA的DACE 區域，對于B區域進行了修飾，將不耐受NaOH的氨基酸去掉。使修飾后的SPA可以耐受0.1-0.5M的NaOH；這就很好的解決了層析介質CIP的問題，同時修飾后的SPA也耐受蛋白酶。減少在純化過程中蛋白酶對SPA的作用，使洗脫收集液中SPA的脫落更低

4、。Protein A 層析介質的發展歷史（GE Healthcare 公司Protein A的 發展史）：1958 年 Protein A 蛋白發現1975年 雜交瘤細胞技術1978年 Protein A Sepharose CL-4B 1988年 Protein A Sepharose Fast Flow 1994年 nProtein A Sepharose Fast Flow 1996年 rProtein A Sepharose Fast Flow 1999年 rmpProtein A Sepharose FastFlow 2001年 MabSelect 2005年 MabSelect X

5、traTM TM TM2005年 MabSelect Sure TM2011年 MabSelect SureLX 注：天然Protein A, 使用CNBr方法與瓊脂糖偶聯重組protein A, 大腸桿菌表達，無動物成分來源，通過CNBr方法與瓊脂糖偶聯重組protein A, 大腸桿菌表達，通過穩定的硫醚鍵與瓊脂糖偶聯重組protein A, 大腸桿菌表達，無動物成分來源，通過還原的氨基與瓊脂糖偶聯，可以多點與IgG結合，吸附兩個IgG分子重組protein A, 大腸桿菌表達，無動物成分來源，通過環氧鍵與高流速瓊脂糖偶聯。重組基因工程protein A, 大腸桿菌表達，無動物成分來源。耐

6、堿Protein A。通過環氧鍵與高流速瓊脂糖偶聯。LX為高載量。 TM2. 用于捕獲抗體的Protein A層析介質的選擇在Protein 捕獲步驟中主要去除的雜質：大部分HCP，DNA；由于 Protein A層析介質對聚體沒有去除作用，所以在此捕獲步驟中應采取盡量減少聚體的形成策略，例如：提高洗脫pH，加入添加劑等 ；在此捕獲步驟中會有Protein A（配基）的脫落。在Protein A捕獲過程中，培養上清中的蛋白酶會降解層析介質的配基Protein A，以及Protein A與介質骨架的偶聯方式，這些都是protein A的脫落原因。所以選擇Protein A脫落較低的層析介質是非常

7、必要的。現在商業化Protein的介質較多，對于不同的項目如何選擇：a Fc融合蛋白：一般Fc融合蛋白的DBC低于單抗。這是Fc融合蛋白的空間位阻效應大于單抗。對于Fc融合蛋白MabSelect Xtra高動態載量的重組protein A介質是比較好的選擇。b FC融合蛋白：如果Fc融合蛋白的穩定性差，尤其是在低pH緩沖液中，可以選擇MabSelect Sure。由于只有FC區域的結合，所以洗脫時的所用的pH較抗體高。 c 表達量高，劑量大的項目可以選擇Mabselect Sure LX。d 不同可變區的抗體在Protein A的DBC也不同，一般VH3 > VH 1>VH2 &g

8、t;VH4 e 修飾后的Protein A 如：Mabselect Sure 對Fab沒有親和作用。2.1 Protein A層析介質選擇的策略A 耐堿性藥物GMP生產最基本的要求是無菌、無熱源。NaOH 是最好的除菌、出熱源的試劑。同時NaOH也是公認的CIP試劑，使用NaOH 可以很好的除去殘留在層析介質上的雜質，以確保工藝的穩定性以及層析介質的壽命；幵且NaoH的成本低。NaOH是公認的CIP試劑，實驗表明，NaOH的清洗效果高于其他試劑。如圖，NaOH清洗Protein A層析介質的效果。圖 用不同CIP試劑清洗后凝膠顆粒上的殘留蛋白。SDS-PAGE（Deep Purple染色）用于

9、評估CIP試劑的清洗效率。NaOH是一種非常高效的清洗試劑，適合瓊脂糖基架的填料。而對照的可控玻璃基架（CPG）填料的清洗結果表明，鹽酸胍比磷酸更為有效。CPG填料在高pH下不穩定，不適合用NaOH清洗。28-9500-94 GE poster傳統的protein A的清洗試劑，如：尿素，鹽酸胍等的清洗試劑效果不理想，幵且在配置時濃度較高，這對生產是一個瓶頸。MabSelect Sure 系列是通過基因工程修飾的Protein 介質，去除了不耐受NaOH的氨基酸，提高了層析介質耐受NaOH的能力。同時 MabSelect Sure LX是最新的Protein 層析介質，結合了耐堿和高載量的性質

10、。另外， Mabselect Sure和Mabselect Sure LX介質在NaoH清洗后壽命可以在300次以上。見圖。圖。使用不同濃度的NaOH 清洗Mabselect Sure 的使用次數。隨著抗體技術的發展，培養條件改善以及表達量的大幅度提高（生產規模已經到達3-5g/L），雜質的量（HCP）也隨之提高。如果不能將介質清洗干凈，這會影響工藝以及產品的質量。在這種情冴下使用高濃度的NaOH （0.5M）的非常必要的（參考GE用于文獻28987296）。B動態載量與保留時間：一般Protein A層析介質的理論載量為80g/L左右。高載量可以減少層析柱的體積。保留時間是指樣品在層析柱內的

11、停留時間或樣品與層析介質的接觸時間。較低的保留時間可以使用較快的流速，從而提高生產效率。在抗體純化工藝開發時，對于動態載量以及保留時間是一個平衡的過程，單純追求高動態載量，可能保留時間會較長，使得上樣時間延長，這樣培養基中的蛋白酶就有時間分解樣品，以及上樣時蛋白酶降解Protein A，使Protein A的脫落增加。另外一些高載量的protein A 層析介質，是通過提高配基密度（Protein A）增加動態載量的。但是配基密度提高過程中，如果配基與的層析基質（骨架）的偶聯不穩定，就會增加protein A的脫落。此類Protein 介質在初期動態載量較高，經過一段時間的使用，隨著配基的脫落

12、，載量很快降低。單純追求高流速，可能會使層析介質的柱壓升高，提高了純化過程中對生產設備（層析柱以及層析系統）的要求，從而增加層析柱以及層析系統的采購成本。隨著上樣次數的增多（生產循環次數的增加）層析介質的反壓增加，從而減少層析介質的壽命。另外，有文獻報道，以硅膠基質或CPG的在重復裝柱的過程中易破碎，從而增加運行的壓力以及影響介質的壽命。現代的Protein A 的動態載量一般在35-60g/L之間，保留時間一般在3-5min左右（20cm柱床高度，線性流速在250-400cm/h ）。隨著細胞培養條件的改善，抗體的表達量的提高（由原來的1-2g/L提高到5g/L以上），對于Protein 層

13、析介質的關注從上樣的速度轉到關注上樣的載量（DBC），關注的是DBC與上樣的速度的平衡。JOB 848 （2007）28-39.C. 低配基脫落配基脫落在單抗藥物中有嚴格的規定，在最終的藥物中protein A 的殘留<10ppm。所以Protein 捕獲步驟中，選擇低protein A的脫落的層析介質對抗體藥物質量控制以及工藝的風險控制是非常關鍵的。Mabselect 系列層析介質的protein A殘留在20ppm以下。采用環氧鍵與高流速瓊脂糖偶聯，增加了偶聯穩定性，從而降低了Protein A的脫落。而其他商用Protein A介質的Protein A為重組， 對于酶的耐受性，以及

14、與骨架偶聯的方式與Mabselect sure 不同，所以在純化中配基脫離量較高，在100-200ppm 以上。. 低非特異雜質吸附Protein A捕獲的樣品是細胞培養的上清液。宿主蛋白是捕獲步驟的主要雜質。雖然Protein A對抗體的Fc有特異性、專一性，但是層析介質的基質（骨架）有時會對雜質有非特異吸附。有文獻報道以聚合物為基質的Protein A層析介質非特異吸附較高，洗脫時宿主蛋白會與抗體共同洗脫。從而HCP的殘留量較高。以瓊脂糖為基質Protein A層析介質非特異吸附較低，一般的洗脫收集的樣品中HCP的殘留在100-200ppm 之間。而以聚合物或的骨架的protein A層析

15、介質的HCP殘留是瓊脂糖骨架的10倍以上。E. 層析介質壓力/流速特性：在生產中層析介質的裝柱是必不可少的一項工作。這與小規模實驗室層析柱的使用是完全不同的。生產中使用的層析柱一般直徑在300mm以上；有些劑量大的項目，生產中需要使用直徑1-1.4m的層析柱。生產規模層析柱的使用關鍵是：操作簡便，裝好的層析柱穩定（經過多次生產循環后，柱效、柱壓、流速等關鍵操作參數穩定）。生產規模層析柱的裝柱不只是層析柱的設計，層析介質的裝柱方法是否適用，以及在裝柱過程中層析介質是否易破碎時關鍵的因素。商業規模的層析介質主要分為兩種：層析介質的壓力/流速曲線在放大過程中例如：CPG為骨架的層析介質在裝柱中需要不

16、斷震蕩，以及裝柱過程易碎。這可能會造成生產的潛在風險。CPG 或多聚物骨架的層析介質較硬，他的壓力/流速曲線為：線性，即隨著流速的加大而升高。所以在生產中由于層析柱（3-4bar）以及層析儀器（6bar）的限制。所以高流速耐壓的性能不能實現；同時，在樣品污染后，有不能使用苛刻清洗試劑清洗（例如：NaOH）所以在使用后期（一般幾十的上樣后，壓力會超過層析柱的限定壓力），是生產中斷。在層析介質的拆裝過程中對于較硬的CPG骨架的介質容易破碎，從而進一步增加使用中的壓力。以瓊脂糖為骨架的層析介質，有一定的彈性。加之可以很好的清洗，所以在生產中可以保持很好的壓力/流速曲線。幵且GE Healthcare有豐富的