1、多管發酵法測定珠江水中的總大腸桿菌群數1 實驗目的 綜合應用微生物學基本原理和基本實驗技術，獨立完成培養基的制備與滅菌操作及微生物的分離、觀察、描述，掌握多管發酵法測定珠江水的總大腸桿菌群數的實驗方法與技術。2 實驗材料 2.1 實驗儀器 超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養箱、顯微鏡、天平等。 培養基：乳糖蛋白胨培養液（分裝于10支25ml試管中，內含倒置德漢氏小倒管）、伊紅美藍（EMB）培養基。 2.2 染色劑 結晶紫液、碘液、95%乙醇、番紅溶液 2.3 水樣珠江水樣 2.4 其他 報紙、橡皮筋、棉塞、標簽紙、無菌水、10.0ml移液管、吸耳球、250ml和100ml錐形瓶、移液槍、培養

2、皿、載玻片、油性筆、接種環、酒精燈、香柏油等 3 實驗步驟 3.1 初發酵試驗3.1.1 乳糖蛋白胨培養液的配制與滅菌 將2.76g乳糖蛋白胨粉末溶解于裝有120mL蒸餾水的錐形瓶中，充分混勻，然后分裝于10支試管中，每支試管裝10ml培養液，再用鑷子夾取德漢氏小套管，并用小滴管灌滿培養液后倒置放入試管中，塞上棉塞，并用報紙包扎好，于121高壓滅菌器中滅菌15min，待冷卻后使用。3.1.2 滅菌水的制備 用100ml錐形瓶裝80ml自來水，塞上棉塞并用報紙包扎好，于121高壓滅菌器中滅菌15min，待冷卻后使用。3.1.3 實驗器皿的包扎與滅菌 用報紙將初發酵實驗用到的10個移液槍頭、一支1

3、0.0ml移液管包扎好，121高壓滅菌器中滅菌15min，待冷卻后使用。3.1.4 稀釋水樣 取5個裝有9ml滅菌水的滅菌試管。取1ml水樣注入第一管9ml滅菌水內，搖勻，再自第一管取1ml至下一管滅菌水內，如此稀釋到第五管，稀釋度分別為10-1，10-2,10-3,10-4,10-5。并貼上做對應的標記的標簽。3.1.5 接種水樣 于已滅菌和冷卻后的裝有10mL乳糖蛋白胨培養液的3個試管中(內有倒管)，分別加入1mL稀釋度為10-3的水樣；于已滅菌和冷卻后的裝有10mL乳糖蛋白胨培養液的3個試管中(內有倒管)，分別加入1mL稀釋度為10-4的水樣；再于已滅菌和冷卻后的裝有10mL乳糖蛋白胨培

4、養液的3個試管中(內有倒管)，分別加入1mL 稀釋度為10-5的水樣。共計9管，三個稀釋度。同時做空白樣品：于1支試管中加入已滅菌和冷卻后的10mL乳糖蛋白胨培養液，加1ml滅菌水。將各管充分混勻，置于37恒溫箱內培養24h。3.1.6 觀察初發酵結果 培養24h后觀察和記錄各試管中產酸產氣（產酸的培養液會變為黃色）的情況，產酸產氣的即為陽性管，并拍照。觀察過程中若只見產酸不見產氣的話，可輕輕拍打試管壁，產生的氣體可能在小倒管內。 3.2 平板分離3.2.1 實驗器皿的包扎與滅菌 用報紙將平板分離用到的培養皿包扎好，于121高壓滅菌20min，待冷卻后使用。3.2.2 伊紅美藍培養基的配制與滅

5、菌 根據初發酵陽性管的數目：將一定量的伊紅美藍培養基粉末溶解于裝有相應量的蒸餾水的錐形瓶中，充分混勻，塞上棉塞并用報紙包扎好，于121高壓滅菌20min后，傾注已滅菌的平皿，待冷卻凝固后使用。3.2.3 平板劃線分離 將培養24h后產酸、產氣及只產酸的發酵管分別接種于伊紅美藍培養基上，置于37恒溫箱內培養24h，挑選符合下列特征的菌落：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。3.3 革蘭氏染色取培養24h后且具有上述特征的菌落進行革蘭氏染色。 3.3.1 涂片 取一張潔凈載玻片，用油性筆在潔凈載玻片的邊緣上標記，于玻片兩端各滴1滴生理鹽水，不

6、要太靠近玻片邊沿。分別挑取少量培養24h后且具上述特征的菌落的菌種1和菌種2于玻片兩端的生理鹽水中，并研磨成均勻渾濁的菌液，涂成約1cm×1cm大小的均勻薄膜，接種環滅菌后放回試管架上。 3.3.2 干燥 涂片最好在室溫下自然干燥，但考慮到時間問題，我們打算將涂膜背面置火焰上方不烤手的高處加烘烤，但切勿緊靠火焰，以免將涂膜烤焦，細菌變形，染色后難以觀察。3.3.3 固定 涂片干燥后，手持玻片的一端，將載玻片的背面往返通過酒精燈火焰三次，共約23秒鐘，注意溫度不可太高，以玻片加溫面觸及皮膚感覺燙而尚能忍受為度。3.3.4 初染 固定完畢且待冷卻后滴加結晶紫溶液，1min后用水洗去。3.

7、3.5 媒染 用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。3.3.6 脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直到流出的乙醇無紫色時，立即水洗。3.3.7 復染 用番紅染液復染約2min，水洗。3.3.8 鏡檢 干燥后用油鏡觀察。菌體呈藍紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。并且拍照記錄。3.4 復發酵3.4.1 根據初發酵陽性管的數目和培養液配方配制一定量的乳糖蛋白胨培養液，分裝、滅菌等步驟同初發酵。3.4.2 上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養液的試管中(內有倒管)，每管可接種

8、分離自同一初發酵管(瓶)的最典型菌落1-3個，然后置于37恒溫箱中培養24h，有產酸、產氣者(不論倒管內氣體多少皆作為產氣論)，即證實有大腸菌群存在。3.5 計算方法本次接種的水樣量是10-3、10-4和10-5 mL/管，濃度較低，需要先查陶雪琴老師等編的環境微生物學實驗指導書（第二版）32頁的表6-8求得MPN指數，再經下面公式換算成每100mL的MPN值。MPN=MPN×10（mL）/接種量最大的一管（mL）4 實驗結果與分析4.1 實驗結果實驗結果見表1，表2和表3及相應注釋。表1 接種用水量水樣種類接種量（ml）10-110-210-310-410-5珠江水00333注:接

9、種管的數目為3。表2 大腸桿菌群數的結果初發酵出現陽性管數復發酵出現陽性管數10-3mL/管10-4mL/管10-3mL/管10-3mL/管10-4mL/管10-4mL/管產酸（溶液變黃色）、產氣產酸（溶液變黃色，顏色較淡）、產氣產酸（溶液變黃色）、產氣產酸（溶液變黃色）、產氣產酸（溶液變黃色）、產氣產酸（溶液變黃色）、產氣根據復發酵陽性管數計算1L水樣中大腸桿菌群數： 7×105 (個/L) 計算過程：先查陶雪琴老師等編的環境微生物學實驗指導書（第二版）32頁的表6-8求得MPN指數為7，則MPN=(7×10/10-4)/0.1=7×105 (個/L)4.2 實

10、驗結果的分析若用最新版的地面水環境質量標準（GB 3838-2002）中的糞大腸桿菌群（個L）標準近似判斷（此版本沒有總大腸菌群該指標）。本實驗總大腸桿菌群7×105 (個/L)為40000，因此判斷本次珠江水樣屬于類。若用舊版的地面水環境質量標準（GB 3838-88）中總大腸菌群（個L）標準來判斷，該標準只有說明總大腸菌群（個L）10000的水體水質為類水，所以只能說明本次珠江水樣不是類和類水。表3 平板分離和革蘭氏染色結果描述平板分離編號來自哪個初發酵管？肉眼觀察（菌種形態、顏色）顯微鏡觀察（菌體形態、顏色）革蘭氏染色結果（陰性、陽性）110-3深紫黑色，具有金屬光澤；圓形、凸

11、起鮮紅色、桿狀陰性210-3紫黑色，不帶金屬；圓形、平扁暗紅色、桿狀陰性310-4深紫黑色，具有金屬光澤；圓形、凸起鮮紅色、桿狀陰性410-4紫黑色，不帶金屬；圓形、平扁紫紅色、桿狀陰性5 思考題5.1 在何種情況下用三倍濃度的乳糖蛋白胨培養基？為什么？答：接種體積為10ml時，試管內應裝入有3倍濃度乳糖蛋白胨培養液5ml。原因是保證在接種完水樣之后，其濃度接近于單料的濃度。而單料的濃度是最適宜大腸菌群生長的。5.2 伊紅美藍培養基含有哪幾種主要成分？在檢查大腸菌群時，各起什么作用？答：商品化的伊紅美藍培養基粉末含有以下成分：蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、瓊脂、氯伊紅、美藍、使用的時候按說明書規定

12、加蒸餾水后充分混勻。在檢查大腸菌群時，蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖是大腸菌群可發酵的糖類；磷酸氫二鉀是緩沖劑；瓊脂是培養基凝固劑；伊紅和美藍是抑菌劑和pH指示劑，可抑制革蘭氏陽性菌，在酸性條件下產生沉淀，形成具有紫黑色菌落或具黑色中心的外圍無色透明等特征的菌落。5.3 為什么大腸菌群的檢驗要經過復發酵才能證實？答：初發酵是樣品的發酵結果，不是大腸菌群純菌的發酵試驗，有可能受其它雜菌影響判斷結果。所以應通過平板分離檢驗是否出現典型的大腸菌群菌落，再進行革蘭氏染色檢驗，若革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌存在，應進行復發酵證實試驗，避免假陽性結果。5.4 所有發酵管均為陰性反應時，檢驗結果可否報告為“零”？答

13、：不可以為零。因為計算總大腸菌群數的時候需要先查表求得MPN得，查表可知，所有發酵管均為陰性反應時MPN值不是零。有可能是此時的接種量未能檢查出大腸菌群。5.5用國標的方法測定一個水樣的大腸菌群數和糞大腸菌群分別需要多久時間？答：用國標的方法測定一個水樣的大腸菌群數需要72h，糞大腸菌群需要48h。5.6 為什么在新修訂地表水環境質量標準（GB 3838-2002）中改用糞大腸菌群指標代替總大腸菌群，而且新修訂的生活飲用水衛生標準（GB 5749-2006）要增加糞大腸菌群這一微生物指標？答：為了有效控制生活污水對地表水質的影響。因為已經證明用糞大腸菌群作為衛生學指標比用總大腸菌群更有代表性，

14、糞大腸菌群只存在于溫血動物的腸道中，而總大腸菌群在某些水質條件下能在水中自行繁殖，不能真實地代表水體受糞便污染的程度。目前，糞大腸菌群被認為是水體受糞便污染的最實用的指示菌。5.7用9管法測定某水樣的大腸菌群數，復發酵結果是接種量為1ml的3管均為陽性，接種量為0.1ml的3管中有2管為陽性，接種量為0.01ml的3管均為陰性，請計算該水樣的總大腸菌群數。（要有計算過程）答：先查陶雪琴老師等編的環境微生物學實驗指導書（第二版）32頁的表6-8求得MPN指數為93，則MPN=(93×10/1)/0.1=9300(個/L)6 心得體會經過這次環境微生物技能訓練之后復習和鞏固了之前學習過的

15、實驗技術，更注意細節了，例如之前做微生物實驗都不夠注意無菌操作導致實驗結果有很大誤差，現在時時刻刻都想著“記得要滅菌”“記得在酒精燈旁邊操作”“千萬不要錯把水樣當無菌水用”。當然也有出現問題。第一，無菌水還沒完全冷卻就開始用來稀釋水樣，可能就是這個原因導致初發酵結果全部是陰性管，后來只能用別的組初發酵陽性管。第二，倒平板的時候不熟練，難以控制每只平板倒的培養基的體積都差不多，我們倒的有些多有些少，不過我們知道我們不熟練，所以多配了點培養基，趁培養基凝固前，把倒少了的平板在酒精燈旁邊再倒多一點培養基。所以我覺得我們還需要多做練習，以后才能做得更規范。我們小組只有兩個人，比別的組少一個，但我們也沒有比別人慢一拍，沒有做得比別人差，所以我們兩個的默契起關鍵作用，同時謝謝在別的組的舍友空余時間幫我們忙。7 附圖110-32產酸產氣產酸產氣10-410-3 圖1 初發酵陽性管 圖2 10-3mL/管的初發酵陽