1、干血點采樣和微透析技術在藥動學研究中的應用 摘要：藥動學研究過程中，傳統的取樣方法存在一定的缺陷，使新的方法應運而生，干血點采樣技術和微透析技術就是其中兩個。本文就它們的原理、目前在藥動學方面的應用現狀、優點與不足之處作概述。關鍵詞：干血點采樣 微透析技術 藥動學進行藥動學研究通常需要從生物體采集大量的全血（臨床前試驗每個時間點通常采集 100500l，臨床試驗 15 ml）以獲得足夠的血漿用于生物定量分析。應用傳統的方法，在臨床前試驗中，每只動物只能獲得一定體積的全血，如果用血量大，則需要將多只動物的血樣混合，這往往導致藥動學數據的可靠性下降，而且對動物的需求量增加。另外，血漿的處理要使用固

2、相萃取、液液萃取或者蛋白沉淀等方法，這些步驟耗時耗力，限制了檢測通量和樣品檢測數量。最后，血樣的運輸和儲存也存在實質上的困難，運輸以及儲存過程需要凍存并妥善處理。由此可見，研究新的采樣方法對藥動學的研究有著不容忽視的意義。本文就兩種非傳統采樣方法進行綜述。1.干血點采樣技術干血點采樣（dried blood spot，DBS），即將全血樣品收集在卡紙上，作為一種采集生物樣品的新型替代技術，在血樣采集方法上比傳統方法有一定的優勢。它需求較少的血量（通常小于 100 L），可減少動物使用，方便血樣采集、存儲運輸，簡化樣品前處理。特別適合小動物的連續樣品采集。有關DBS樣品采集、干燥、儲存和運輸、前

3、處理等方面的綜述如下：1.1 DBS 樣品采集方法1.1.1 DBS 采樣卡FTA 和 FTA Elute 卡，可用于 DBS 采樣，兩種卡通過適宜的化學試劑處理后，具備溶解細胞，使蛋白變性，并且抑制細菌等其他微生物生長的功能。1.1.2 DBS 樣品采集過程 在臨床前研究中，小動物（如小鼠、大鼠）可以從尾部采血。血樣可直接滴到采樣卡的圓圈內，應避免直接接觸到卡紙，尤其是在采樣前和血樣未干燥前。還應避免凝血、分層以及過飽和等情況的發生。血樣應均勻分布在圓圈內，采樣卡兩側血樣的顏色應保持一致。如果樣品被污染，出現溶血現象或者采樣體積不夠，均為不合格的采樣。也可以使用加樣槍將血樣點到采樣卡上，這樣

4、可避免潛在的血細胞比容差異、采血量的影響、血樣在采樣卡上分布不均勻等采樣錯誤。加樣槍頭應距離采樣卡若干毫米，當血樣碰觸到卡時會迅速分散開，使血樣在卡上分布均勻。1.2 DBS 樣品干燥、儲存和運輸方法 在儲存和運輸前將 DBS 樣品充分干燥是十分重要的。一般而言，在室溫開放環境（1522 ）下，干燥時間至少為 23 h。干燥時間取決于采樣卡的類型以及采血量的多少。樣品不應該加熱、重疊放置或者接觸其他表面，需要的話應避免陽光直射。潮濕可能引起細菌生長，改變提取效率或者促進不穩定分析物的降解，從而導致血樣的分析質量下降。因此在干燥之后，為避免 DBS 樣品接觸水分或濕氣，可用紙覆蓋 DBS 樣品并

5、裝進含有干燥劑的封口袋里，另外，包裝袋內應含有濕度指示劑。通過這種方式包裝的 DBS 樣品可在室溫下儲存數周至數年。如果樣品含有不穩定的化合物，則應儲存在低溫環境（28 、15 或60 ）。按照上述方法包裝的 DBS 樣品可通過郵寄方式運輸，在此期間不需考慮血樣暴露或者傳染性物質等問題。1.3 DBS 樣品前處理方法1.3.1 打孔位置的選擇 為考察全血在 DBS 卡上的分布情況，根據干血點的直徑大小，選擇中心及邊緣位置打孔得到相同尺寸的濾紙片，處理后進行樣品分析，隨行標準曲線測定其濃度。研究表明，打孔位置會直接影響DBS 樣品定量分析的結果。如果點卡體積小而打孔面積大，那么所測結果的精密度會

6、比較好；如果點卡體積大而打孔面積小，那么所測結果的精密度會比較差，原因可能是卡紙成分的干擾。唯一能精確地對待測物進行定量分析的方法為點卡體積完全相同，從卡上取下所有的血點。1.3.2 離線提取 在定量分析中，從 DBS 卡上打下一個或多個一定直徑的圓片放入分析試管或 96 孔微量滴定盤中進行提取。提取時通常加入一定量的含有內標的提取溶劑（甲醇、乙腈或者一定比例的水-有機溶劑混合物）。選擇合適的提取溶劑破壞基質或濾紙里分析物與蛋白的結合，并通過振蕩或者渦旋等方式將分析物洗脫下來，渦旋時間一般為 2060 s，必要時也可采用超聲處理來提高提取效率。離心之后，提取物手動或自動轉移到試管或微量滴定盤中

7、直接進樣，或者吹干后用流動相復溶進樣。1.3.3 在線提取 最近有報道關于 DBS 樣品的在線提取方法。該方法基于“inox cell”結構，可以將濾紙片上的分析物洗脫下來，隨即導入 LC-MS 系統，從濾紙上釋出的分析物通過色譜分離后進入質譜檢測。1.4 樣品穩定性 根據 DBS 的采樣情況，應對分析物（以及代謝物）在室溫下不同介質以及不同存放時間進行穩定性考察，以確定 DBS 的存放條件和時間。具體的穩定性試驗應包括儲備液的穩定性、樣品處理后的溶液中分析物的穩定性、分析物在全血中的穩定性、含藥全血點樣后室溫放置的穩定性、含代謝物全血點樣后室溫放置的穩定性等。1.5總結相較于傳統的血漿采集方

8、法，在藥動學研究中使用 DBS 采集全血樣品具備了一定優勢。但是作為一種新方法，DBS 法尚存在以下不足。測定結果的準確性可能受點樣條件（工具、溫度、體積）影響；樣品量少，靈敏度不高；不適用于不穩定的藥物（如易于氧化、酶解的藥物）。雖然 DBS 技術還處在開發期，有待完善，但其較一般樣品采集及處理方法顯示出的優點使其在藥動學研究的應用范圍越來越廣泛。2. 微透析技術2.1 基本原理 微透析技術可在基本不干擾生物體正常生命過程的情況下進行在體、實時和在線取樣與檢測。其原理是基于物質自由擴散，將具有一定孔徑的纖維半透膜制成探針（probe）植入待測的組織內，以恒定速度向探針內灌流與組織成分相似的等

9、滲灌流液。當灌流液流經探針的頂端時，組織內小分子量生物活性物質即順濃度梯度從膜外擴散至膜內，并隨灌流液被引流至探針外，按一定的時間間隔連續收集透析液，用現檢測儀器檢測其中待測生物活性物質水平，可監測該區域內細胞外生物活性物質濃度的經時變化過程。2.2 系統組成微透析系統的組成主要分為四個部分，微注射泵、微透析探針、微收集器以及連接這些部分的導管。其中最主要的部分是微透析探針。微透析探針有多種類型，同心圓型的探針是現在應用最為廣泛的探針。這種探針是一種頂端連有半透膜的同心圓型套管，主要應用于腦內微透析實驗。除了同心圓形探針外還有柔性探針、線性探針、分流探針等，每種探針所應用的條件是不同的，在實驗

10、時需要根據實驗的具體要求來選擇不同類型的探針進行實驗。2.3 技術特點 微透析方法與傳統的方法相比，主要具有以下幾個方面的特點： （1）微透析技術可以實時監測目標化合物在體內的分布以及多種化合物在靶器官內的濃度隨時間變化的趨勢。這就為研究藥物在體內的分布、吸收、代謝及排泄過程提供了有力的手段。 （2）微透析技術既可以在麻醉動物身上取樣，也可以在自由活動的清醒動物身上取樣，且對動物的組織損傷小，能從同一動物收集大量的樣本而不損失體液量，從而避免了傳統研究方法中因采血后血容量減少所造成的對藥物分布及消除的影響。微透析技術方法應用于藥物代謝動力學的研究，減少了實驗動物的使用量，排除了個體差異對實驗結

11、果的影響（在同一只動物身上可以得到一套完整的藥動學參數），保證了實驗結果的準確性。 （3）微透析取樣技術所采集的樣本是不含蛋白質等大分子物質的游離態小分子化合物，其結合現代檢測方法后，可以不經過預處理直接進行分析，減少了樣品的損失和誤差，使得到的藥動學參數的可靠性和準確性也相對較高。且由于蛋白質無法通過微透析探針的半透膜，故不會因在室溫取樣而發生酶解反應，提高了樣品的穩定性。2.4微透析取樣技術在藥動學研究中的應用2.4.1 微透析取樣技術在腦內藥動學研究中的應用 腦微透析技術采用了截留不同分子質量物質的透析膜制成微透析探針,利用腦立體定位儀將探針埋入指定的組織區域,將灌流液以一定速率泵入探針

12、進液管,腦細胞外液中的小分子生物活性物質或藥物根據Fick's定律通過探針中具有一定孔徑的透析膜,順濃度梯度在細胞外液與灌流液之間擴散,隨著灌流持續進行,膜內的灌流液隨時更新,膜兩側濃度梯度得以維持,因此小分子物質可持續順濃度梯度擴散,以一定時間間隔收集探針流出液并采用高靈敏的分析技術進行定量分析,從而實現對腦特定部位細胞外液中生物活性物質的動態監測。由于物質順濃度梯度跨膜運動可雙向進行,所以腦微透析技術除了用作動態監測腦內細胞外液的的生化改變,還可作為一種給藥途徑用于腦內特定部位的給藥。微透析技術在測定藥物向腦內分布和轉運具有明顯的優勢，且微透析探針的剛性結構適合于腦內試驗，結合腦立

13、體定位儀可以準確的定位到腦內的各個分區，且具有很高的時間分辨率和空間分辨率。 腦微透析技術為研究腦內的神經遞質改變、特定部位細胞外液藥物濃度的監測等提供了有效的技術支持。但作為一門新興的技術,它仍存在一些問題,包括缺乏準確易操作的探針回收率校準方法和可滿足小體積、低濃度的靈敏的分析方法、微透析探針植入對腦內環境的影響不確定、目前只能通過微透析技術采集小分子物質、親脂性藥物易產生吸附、可重復使用性差導致成本高等,這些都限制了其在PK和PK/PD研究中更廣泛的應用。2.4.2 微透析取樣技術在外周組織及血液藥動學研究中的應用2.4.2.1皮膚 對皮膚及皮下脂肪組織的藥動學研究傳統的方法有起皰技術、

14、皮膚刮取術、膠帶剝離術等，但這些方法都無法反映皮膚局部藥物的吸收過程，且會出現皮膚變性、細菌生長等問題。DMD技術能進行在體原位檢測，對皮膚破壞??；可選擇性地采集非結合性藥物；可同時在多位點進行采樣。與此同時，DMD具有能同時采集外源性和內源性化合物的特點，因此近年來，該技術在皮膚病生理機制及藥效機制研究領域發揮著重要的作用，成為少數適合于研究皮膚藥動學進而評價經皮制劑生物利用度和生物等效性的研究方法之一。2.4.2.2 眼 對眼藥的藥動學研究中微透析方法也能適用?？梢垣@得藥物在眼局部的吸收、分布及從眼部消除的資料。微透析法應用于眼科藥代動力學研究中不僅能使實驗的準確度更高，而且能節省實驗動物

15、，減少動物不必要的損失。2.4.2.3 膽 膽微透析技術是微透析技術的一種，是一門新興的"用途廣泛的技術，是將一種具有透析作用且充滿液體的微細探針置于膽管內，與探針周圍組織進行物質交換后測定其內的化學物質含量的技術，能直接"有效地對膽汁中的藥物及其代謝產物濃度進行持續檢測，是藥物動力學研究的重要工具，具有不可替代的作用及廣闊的應用前景。2.4.2.4 血液 藥動學分析方法最常用的方法是血藥濃度法。這種方法操作簡單，實驗技術含量小，但是會不斷的減少動物的體液，特別是對體型較小的動物，會使實驗受影響產生較大誤差。且取出的血液樣本要經過預處理后才能進行分析，使得實驗結果受到影響。

16、微透析方法則不存在這些問題，將血液微透析探針直接放入動物的血管中，可以動態的檢測血藥濃度的變化，在長時間的取樣過程中，動物的體液量并不減少，可以在一只動物的體內得到一套較完整的藥動學參數。且實驗動物可以自由活動，實驗過程可以長達數天。這樣既節約了實驗動物，又可以提高實驗數據的準確性。2.3.總結 綜上所述，微透析技術是藥物代謝動力學研究的重要工具，與傳統取樣方法相比其不引起體液的損失，定位更加精確，在同一只實驗動物身上獲得資料更多，減少了個體差異對實驗結果的影響。隨著微透析探針在設計上的不斷改進，可以將微透析探針插入藥物作用的靶器官，以監測藥物在靶器官中的濃度，從而更加準確地為藥物在臨床上合理

17、使用提供科學依據。不可否認微透析技術還存在一些局限性。如：每個微透析探針的價格較高且只能使用一次、微透析探針的相對回收率較低、透析液量少、對分析儀器的靈敏度要求高，在臨床上使用較少，現基本只是應用于藥物代謝動力學的基礎研究。然而，隨著微透析技術的發展和現代高精密度的分析儀器的不斷的出現，微透析技術在藥物代謝動力學方面的應用前景將是不可估量的，會成為研究藥物代謝的常規實驗技術。3. 結語 干血點采樣和微透析技術在藥動學研究中具有不可替代的作用，但仍有不足之處，尚需繼續研究不斷改進完善。參考文獻：1. 劉勇,魏廣力,夏媛媛,肖淑華,司端運. 干血點采樣技術及其在藥動學研究中的應用. Drug Ev

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