1、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）1.定義22.原理22.1抗原抗體反應22.2免疫測定在臨床檢驗中的應用43.ELISA的類型43.1雙抗體夾心法測抗原：53.2雙抗原夾心法測抗體53.3間接法測抗體53.4競爭法測抗體63.5競爭性測抗原63.6捕獲包被法測抗體63.7ABS-ELISA法74.ELISA試劑的組成84.1固相載體：84.2包被的方式84.3包被用抗原：天然抗原、重組抗原、合成多肽抗原。94.4包被的條件：94.5洗滌液：94.7酶的催化性；104.8結合物的制備104.9結合物的保存114.10酶的底物114.11酶反應終止液114.12參考標準品124.13加樣：124.

2、14保溫124.15保溫方式：124.16室溫溫育的反應124.17洗滌134.18顯色134.19比色134.20酶標比色儀144.21結果判定144.22定量測定154.23ELISA的操作要點151. 定義酶聯免疫吸附測定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），簡稱ELISA，采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，對受檢物質進行定性或定量分析的一種檢測方法。2. 原理采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，可對受檢物質的定性或定量分析。2.1 抗原抗體反應2.1.1 可逆性抗原與抗體結合形

3、成抗原抗體復合物的過程是一種動態平衡，其反應式為：Ag+AbAgAb抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數K表示：K=AgAbAgAb，AgAb的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原和抗體均能保持原有的結構和活性。2.1.2 特異性抗原抗體的結合發生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間?；瘜W結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。因此，在很多時候，測定某一特定的物質不需分離待測物。2.1.3 最適比例只有當抗原抗體的濃度比例是當時，才出現可見反應。以沉淀反應為例（Ab量固定，Ag量遞增）圖（1）該理論的支

4、持者網格學說，其成立的三個條件： 抗原多價，抗體雙價； 二則比例合適； Ag/Ab過剩。當抗原抗體濃度比例合適時，抗體的兩個Fab段分別結合兩個Ag分子，相互交叉結合連接成巨大的網格狀立體聚合物，沉淀可見，如圖b。Ab/Ag過剩時，過剩方的結合價得不到飽和，大多數游離存在，只形成小分子復合物，沉淀不可見，如圖a，c，d。圖（2）2.1.4 敏感性化學比色法的敏感度為mg/mL水平；酶反應測定法的敏感度約為5-10g/mL；免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應相仿；標記的免疫敏感度可提高數千倍，達ng/mL水平。如HBsAg，其敏感度可達0.1ng/mL。2.2 免疫測定在臨床檢驗中的應

5、用由于各種抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可測試標本中的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣。3. ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑： 免疫吸附劑：固相的抗原或抗體； 結合物：酶標記的抗原或抗體； 底物：酶催化的此物。常見的檢測方法有：雙抗體夾心測抗原、3.1 雙抗體夾心法測抗原：圖（3）此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可以用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。3.2 雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原

6、進行包被和制備酶標結合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。3.3 間接法測抗體間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。3.4 競爭法測抗體圖（4）當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。3.5 競爭性測抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作為夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本

7、中的抗原含量越多，結合在固相上的酶標抗原越少，最后顯色也越淺。小分子激素、藥物等多用此法。3.6 捕獲包被法測抗體以IgM抗體為例。血清中針對某些抗原的特異性IgM常和非特異性IgM，以及特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM的測定。捕獲法則較好地解決了上述問題，其原理是先用抗人IgM（鏈）抗體包被固相載體，使血清中所有IgM(包括特異性與非特異性IgM)均固定在固相上，經洗滌去除IgG后，再測定特異性IgM。此方法目前主要用于檢測各類早期感染的特異性抗體IgM。3.7 ABS-ELISA法ABS為親和素（avidin）生物素（biotin）系統（system）的略語。親和素是一種糖蛋白，分子

8、量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由于一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然后再加酶標記的生物素以進一步提高敏

9、感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。4. ELISA試劑的組成ELISA試劑中有三個必要的組成部分：免疫吸附、結合物、酶的底物。常見的組成如下： 已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； 酶標記的抗原或抗體（結合物）； 酶的底物； 陰性對照品或陽性對照品，參考標準品； 結合物及標本的稀釋液； 洗滌液； 酶反應終止液；4.1 固相載

10、體：聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍能保留原來的免疫學活性。聚氯乙烯，對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一條各孔之間性能相近。4.2 包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非常特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質抗原

11、，可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素，即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。脂類物質，無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發后，讓脂質自然干固在固相表面。優點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性也好，抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至1/100。4.3 包被用抗原：天然抗原、重組抗原、合成多肽抗原。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片

12、段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高、特異性也高。但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。包被用抗體：IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯接發生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養液，須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。4.4 包被的條件：Ph9.6碳酸鹽緩沖液；pH7.2磷酸鹽緩沖液；Ph7-8 Tris-HCl緩沖液；加入包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，37中保溫2

13、小時。包被濃度隨載體和包被物的性質可能有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/mL-20ug/mL。封閉：在包被后，用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉讓大量無關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后步驟中干擾物質的再吸附。常用的封閉劑：0.05%-0.5%BSA；10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可以用高濃度（5%）。4.5 洗滌液：在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。4.6 結合物：即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑。4.7 酶的催化性；抗體（抗原）的免疫活性；含有或少含

14、有游離的抗體（或抗原）；結合物要有良好的穩定性。結合物用的抗原和抗體制備結合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯結時其他蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本地淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。酶純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。在ELISA中有HRP,AP,葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44

15、000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。4.8 結合物的制備酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質的氨基酸通過它而聯結。有效（結合率達60%-70%）和重復性好。但是交聯反應是隨機的，結合物的大小不一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成chiff氏而結合。簡單有效。結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶的活性測定，但會與酶標抗體競爭相應的固相抗

16、原，因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節省。4.9 結合物的保存酶和抗體均為生物活性物質，易失活。高濃度較為穩定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳汞，AP結合物可加疊氮鈉）。結合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的

17、緩沖液配制成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8保存期可達6個月。4.10 酶的底物1) HRP的底物DH2+ H2O2D+ 2H2O上式中，DH2為受氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物。DH2如鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯苯胺（TMB）和ABTS。OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。TMB經HRP作用后的產物顯藍色。TMB性質較穩定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混合即成應用液。酶反應終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABT

18、S雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分子醇的過氧化物和尿素過氧化物。AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩定一段時間。AP也有發熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。4.11 酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。對照設定陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照

19、。陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。加入的量應與試劑的敏感度想稱；在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量。陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。4.12 參考標準品定量測定（如甲胎蛋白質，癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。標本的采取和保存體液、分泌物、排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標本為例，血漿含有纖維蛋白原、抗凝劑，其他成份同血清。血

20、清標本應避免溶血。紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。基本操作注意事項4.13 加樣：在ELISA中一般有3次加樣步驟，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。4.14 保溫抗原抗體完全反應的保溫過程稱為溫育。ELISA屬于固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。溫育常常用的溫度有43、37、室溫和4等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。4.15 保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊、水浴。若用保溫箱：E

21、LISA板放在濕盒內，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板都放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，以保證格板的溫度都能迅速平衡。4.16 室溫溫育的反應操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指在20-25，但具體操作時可根據說明書 要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。4.17 洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，卻也決定著實驗的成敗。ELISA洗滌：達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種

22、非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f，在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有的特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種。1) 流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。2) 浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含有疏水基團，也含有親水基團，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。4.18 顯色顯色是酶催化無色的底物生

23、成有色產物的溫育反應。反應的溫度和時間仍然是影響顯色的因素。在一定的時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證試驗結果的穩定性，最好在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。4.19 比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。以蒸餾水校準零點，測量讀取底物孔（未經任何反應僅僅添加底物溶液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水

24、校準零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。結果以光密度（oplical density,OD）,先按規定用吸光度（absorbence,A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為“A492nm”或“OD492nm”。4.20 酶標比色儀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測量范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可以精確到0.001，準確性為1%，重復性達0.5%。操作時室溫宜在15-30，使用前先預熱儀器15-30分鐘，