1、SNP檢測技術 內容簡介1 SNP 概概 念念2 SNP 特特 點點3 SNP 檢檢 測測 技技 術術4 實實 驗驗等位基因和基因型等位基因和基因型 位于一對同源染色體的同一位置（基因型）上、位于一對同源染色體的同一位置（基因型）上、控制相對性狀的兩個不同形式的基因叫等位基因。控制相對性狀的兩個不同形式的基因叫等位基因。 一個基因由于突變（包括中性突變）可形成一個基因由于突變（包括中性突變）可形成2 2個個以上的等位基因，不同的等位基因可產生不同的遺傳以上的等位基因，不同的等位基因可產生不同的遺傳特征的變化，同時控制相對性狀的顯、隱性關系和遺特征的變化，同時控制相對性狀的顯、隱性關系和遺傳效應

2、。如由突變形成的多種等位基因可產生多種異傳效應。如由突變形成的多種等位基因可產生多種異常表型。常表型。 正常基因稱為正常基因稱為野生型基因野生型基因：具有野生型：具有野生型基因的細胞或個體稱為基因的細胞或個體稱為野生型野生型（wild type）。）。 基因突變（基因突變（gene mutation）：攜帶突變）：攜帶突變基因的各種類型的細胞或個體稱為基因的各種類型的細胞或個體稱為突變體或突突變體或突變型變型（mutant）。）。一、SNP 的概念 p單核苷酸多態性單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于單個核苷酸堿基的改變而導致的核酸序列

3、的多態性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現象，即SNP。一般而言，SNP 是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異。p它包括單堿基的轉換, 顛換、 插入及缺失等形式A/ GA/ G、A/ TA/ T、A/ CA/ C、C/ GC/ G、C/ T C/ T 和和G/ G/ T T轉換的發生頻率占多數二、SNP在基因組內的形式:p一是遍布于基因組的大量單堿基變異一是遍布于基因組的大量單堿基變異; ; p二是分布在基因編碼區二是分布在基因編碼區(coding region) , (coding region) , 稱其稱其為為cSNPcSNP

4、，屬功能性突變。，屬功能性突變。 SNPSNP在單個基因或整個基因組的分布是不均勻的：在單個基因或整個基因組的分布是不均勻的： （1 1）非轉錄序列非轉錄序列要多于要多于轉錄序列轉錄序列（2 2）在轉錄區）在轉錄區非同義突變非同義突變的頻率的頻率, , 比比其他方式突變其他方式突變的頻率低得多。的頻率低得多。 三、SNP 的特點 p在遺傳學分析中在遺傳學分析中, SNP , SNP 作為一類遺傳標記得以廣泛作為一類遺傳標記得以廣泛應用應用, , 主要源于這幾個特點主要源于這幾個特點: : （1 1）密度高密度高SNPSNP在人類基因組的平均密度估計在人類基因組的平均密度估計為為 11000 b

5、p , 11000 bp , 在整個基因組的分布達在整個基因組的分布達 3 310106 6個個, , 遺傳距離為遺傳距離為 2 23cM , 3cM , 密度比微衛星標記更高密度比微衛星標記更高, , 可以可以在任何一個待研究基因的內部或附近提供一系列標在任何一個待研究基因的內部或附近提供一系列標記。記。（2 2）富有代表性富有代表性某些位于基因內部的某些位于基因內部的SNP SNP 有可有可能直接影響蛋白質結構或表達水平能直接影響蛋白質結構或表達水平, , 因此因此, , 它們可能它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素。代表疾病遺傳機理中的某些作用因素。 （3 3）遺傳穩定性遺傳穩定性

6、與微衛星等重復序列多態性與微衛星等重復序列多態性標標記相比記相比, SNP , SNP 具有更高的遺傳穩定性。具有更高的遺傳穩定性。（4 4）易實現分析的自動化易實現分析的自動化SNPSNP標記在人群中標記在人群中只有兩種等位型只有兩種等位型(allele) (allele) 。這樣在檢測時只需一。這樣在檢測時只需一個個“ “ + - ”+ - ”或或“全全 無無”的方式，而無須象檢測限的方式，而無須象檢測限制性片段長度多態性，微衛星那樣對片段的長度制性片段長度多態性，微衛星那樣對片段的長度作出測量，這使得基于作出測量，這使得基于SNPSNP的檢測分析方法易實現的檢測分析方法易實現自動化。自動

7、化。四、多態性與突變的區別p1、多態性是一個群體概念，多態性指這個差異占群體的1%以上。否則就叫突變（小于1%）p2、SNP是多態性中的一種，只是進一步限定了差異只是單堿基。p3、SNP一般來說，是全部體細胞一樣的基因型（除開嵌合體）。p4、突變一般不是一個個體全部細胞的變化。p5、如果突變發生在生殖細胞，則可以遺傳，但是只要這個突變群沒有達到總群體的1%，它就只是一個突變株/系。達到了1%就是多態性了。五、 SNPs經典檢測方法p一大類是以凝膠電泳為基礎的傳統經典的檢測方法,如: 1 . 限制性片段長度多態性法 PCR- RFLP ; 2 .單鏈構象多態性法 PCR- SSCP ; 3 .

8、變性梯度凝膠電泳 ( denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE ); 4 .等位基因特異性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等另一類，基因芯片、二代測序技術（一）PCR-RFLP方法 原理：原理：利用限制性內切酶的酶切位點的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點，酶切片斷的長度和數量則會出現差異，根據電泳的結果就可以判斷是否SNP位點。 特點：特點：該技術應用的前提是SNP的位點必須含有該限制內切酶的識別位點，它是SNP篩查中最經典的方法之一.PCR-RFLP原理圖（二）

9、單鏈構象多態性(SSCP) 原理：原理：單鏈DNA 在中性條件下會形成二級結構，不同的二級結構在電泳中會出現不同的遷移率。這種二級結構依賴于堿基的組成，單個堿基的改變也會影響其構象，最終會導致在凝膠上遷移速度的改變。 在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈 DNA 和RNA 分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現不同的條帶，檢測SNP。特點：特點：由于該方法簡單快速，因而被廣泛運用于未知基因突變的檢測。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置。（三）變性梯度凝膠電泳（DGGE）p原理：原理：是利用長度相同的雙鏈 DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過梯度變性膠將

10、 DNA片段分開的電泳技術。 電泳開始時,DNA 在膠中的遷移速率僅與分子大小有關, 而一旦DNA 泳動到某一點時, 即到達該DNA 變性濃度位置時, 使得DNA 雙鏈開始分開,從而大大降低了遷移速率。當遷移阻力與電場力平衡時, DNA 片段在凝膠中基本停止遷移。由于不同的DNA 片段的堿基組成有差異, 使得其變性條件產生差異, 從而在凝膠上形成不同的條帶。（四）等位基因特異 PCR ( AS-PCR)原理：原理：根據 SNP位點設計特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3末端與 SNP位點的堿基互補(或相同) ,另一條鏈(普通鏈)按常規方法進行設計,因此,AS-PCR技術是一種基于SNP的PCR標

11、記。因為特異引物在一種基因型中有擴增產物,在另一種基因型中沒有擴增產物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產物的有無,從而確定基因型的 SNP。PCR條件優化pTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶：1-5U/100ul,濃度過高-非特異擴增，過低-產量不足。pdNTPdNTP: :20-200mol/L,四種濃度要相等，任何一種不等都會發生錯配。pMg+濃度：0.5-2.5mmol/L,一般反應中，各種dNTP濃度為200mol/L時，Mg2+濃度為1.5-2.5mmol/L為宜，過高-非特異性，過低-酶活性降低。p引物濃度：0.1-0.5 mol/L,過高錯配、特異擴增，二聚體p模版濃度

12、、質量100-200ng/100ulp偏向性擴增的解決偏向性擴增的解決 所謂偏向性擴增是因為SNP位點上會往往存在嘌吟和嘧啶的替換，在PCR過程中，聚合反應對嘧啶(C或T)比較敏感，使得嘌吟(A或T)的擴增非常少，而出現偏向性擴增，這在SNP位點附近嘌吟含量較高時特別明顯。解決方案：（1）PCR擴增循環保持一個絕對低的水平；（2）在樣本中加入 0.1N NaOH使DNA變性為單鏈，經中和后加入全基因組擴增試劑。（3）巢式PCR-RFLP”基因分型技術AAAAGAAAAGG GAAGATCCCAAAAGATCCCAATTTTCTTTTCC CTTCTAGGGTTTTCTAGGGTTAAAAGAA

13、AAGT TAAGATCCCAAAAGATCCCAATTTTCTTTTCA ATTCTAGGGTTTTCTAGGGTTpQIAGEN REPLI-g試劑盒PCR反應出現的問題與對策p1、假陽性出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。二是空氣中的小片段核酸污染p解決方法：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加

14、樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。p2、出現非特異性擴增帶 PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。 原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。p對策：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，

15、適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性，65左右退火與延伸)。p3、出現片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環次數。p優點：這個方法是最便宜的， 不需要酶切， 一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。p缺點： PCR對于3端的特異性在不同退火溫度時有出入， 所以退火溫度的摸索很關鍵，否則假陽性擴增是很容易的。p另外， 內參照的設

16、置也很重要，這個東西還是很有意思的。 而且，所使用的引物位置無法人為調整，只能放在SNP的5段。p其基本原理是利用PCR引物的3端，對SNP位點附近的堿基進行人為改造，產生一個常規的限制性內切酶識別序列，如SNP rs1321425（rs1321425來自NCBI的refSNP數據庫）的C/G，其任何一個堿基和上下游堿基無法形成一個可直接被限制性內切酶識別的序列，于是對SNP位點前的上游堿基進行改造，（五）巢式PCR-RFLP技術Nested PCR原理示意圖原理示意圖First PCRSecond PCRp通過對序列的分析和PCR效果的計算，將原本四個堿基AGAT改成CTGC，結合后一個堿基

17、A 以及SNP位點G，形成CTGCAG（PstI）酶切識別位點，經測序和序列對比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的將2 個堿基，3個堿基進行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT32（六）雜交+熒光共振分子信標（雙分子間雜交） 蝎狀探針（分子內雜交）1、分子信標（Molecular beacons）p分子信標是一種新型的發卡結構的寡核苷酸探針,是在樣品PCR過程中因和樣品DNA 雜交后而使

18、自身熒光構象改變從而實現對SNP的檢測(原理見圖1) 。分子信標由稱為“莖”(stem)和“環”(loop) 的兩部分構成,莖部分是由寡核苷酸探針兩端互補的序列形成的,又可稱之為手臂,環則是探針的中間部分,其序列和待擴增的目的片段互補并含有要檢測的SNP 位點。在手臂的兩個末端分別通過共價的方式結合上一個熒光分子和一個熒光猝滅基團,這樣當分子信標游離在溶液時,它p以發卡結構存在,熒光分子與猝滅基團在空間距離上挨在一起,十分接近,熒光分子被猝滅,此時溶液無熒光信號。相反當分子信標和其完全互補的目的片段雜交時,其發卡結構被拉開而使熒光分子和熒光猝滅基團在空間上分開從而發射出熒光,其信號可提高900

19、倍。特異性很高,相差一個堿基的目的片段都能夠區分,因此用于SNP位點的檢測,同時我們可以對分子信標標記以不同的熒光信號,從而能夠對多個樣品的同時檢測。由于分子信標是在樣品PCR 過程中的退火時期和目的片段特異性雜交,釋放熒光,某一循環或循環后的熒光量取決于那時形成的特異的PCR 產物,因此也用于PCR 產物產量的實時檢測。 362、蝎狀探針 （Scorpion primer） pScorpion primer 是由發卡結構(hairpin loop) 的探針部分，通過一段稱為PCR stopper (or PCR blocker) 的寡核苷酸和PCR 引物的5端相連構成。p探針部分的結構和Mo

20、lecular beacons 類似,由互補序列構成的“莖”和包含SNP位點且和待檢測目的片段。p而PCR stopper 的作用是在PCR 過程中阻止對探針部分的擴增,避免發卡狀結構在無待檢測片段時通過擴增被打開而產生錯誤的熒光信號。p在對樣品進行檢測時以Scorpion primer 作為PCR擴增的引物,當其以樣品DNA作為模板延伸后,Scorpion primer 中的探針部分就可以和同一條DNA鏈上的互補部分雜交,而導致自身構象的改變釋放出熒光信號互補的“環”構成,熒光分子和猝滅基團分結合在莖的末端,（七）SNPs高通量的檢測方法 另一大類檢測方法是近些年來發展起來的, 高通量、 自

21、動化程度較高的檢測 SNPs的方法,較為常用的有: 1 . DNA測序法; 2 . DNA芯片檢測; 3 . 飛行質譜儀 (MALDI- TOFMS )檢測; 4 . 變性高效液相色譜 ( DH PLC )法等等1、DNA測序法p直接測序是最容易實施的SNP檢測方法。原理原理: 通過對不同個體同一基因或基因片段進行測序和序列比較, 以確定所研究的堿基是否變異, 其檢出率可達100%。 特點：特點：可以得到SNP 的類型及其準確位置等SNP分型所需要的重要參數。2、基因芯片技術( Genechips) 原理原理: :是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的載體上，待測基因經提取、熒光標記后，與固定

22、好的探針進行雜交，最后根據熒光的強度和種類測出待測序列的堿基類別。 特點：特點：基因芯片具有信息量大和自動化程度高的突出優點。但它也存在若干問題: 芯片造價高昂, 所需設備貴重, 不利于普及應用。3、飛行質譜儀 MALDI-TOF 原理：原理：是將變性的單鏈PCR產物通過與硅芯片上的化合物共價結合后, 在硅芯片上進行引物的退火, 延伸反應, 突變部位配對的堿基與正常配對的堿基不相同。根據引物在延伸反應中所結合的不同堿基的不同質量在質譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。4、變性高效液相色譜( DHPLC)原理：原理：目標核酸片段PCR擴增，部分加熱變性后，含有突變堿基的DNA序列由于錯配堿基與正常堿基

23、不能配對而形成異源雙鏈。因包含錯配堿基的雜合異源雙鏈區比完全配對的同源配對區和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來, 從而達到分離的目的。SNPs的有無最終表現為色譜峰的峰形或數目差異,依據此現象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基。特點：特點：使用高效液相色譜檢測SNPs具有檢測效率高，便于自動化的優點，對未知SNPs的準確率可達95%以上。但DHPLC檢測對所用試劑和環境要求較高,容易產生誤差, 不能檢測出純合突變。5、MassARRAYpSNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術是Sequenom公司推出的世界上領先的基因分析工具，通過引物延伸或切割反應引物延伸或切割

24、反應與靈敏、可靠的MALDITOF質譜質譜技術相結合，實現基因分型檢測。p基于MassARRAY 分子量陣列平臺的iPLEX GOLD技術可以設計最高多達40重PCR反應和基因型檢測，實驗設計非常靈活，分型結果準確性高。特別適合于對全基因組研究發現的結果進行驗證，或者是有限數量的研究位點已經確定的情況。MassARRAY技術原理技術原理:p先通過PCR擴增目標序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP 位點上，延伸 1個堿基。p將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶后在質譜儀的真空管經強激光激發，核酸分子解吸附為單電荷離子，電場中離子飛行時間與離子質量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行

25、時間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點信息。MassARRAY技術原理技術原理:pMassEXTEND：單堿基延伸反應，緊挨SNP位點設計一段探針，在反應體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點處延伸一個堿基即終止。根據SNP位點的不同，探針將結合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質譜儀即可檢測出這種分子量差異，從而實現SNP分型的目的。MassARRAY技術流程：技術流程： 當前SNP功能研究主要有以下幾方面：p1)報告基因轉染技術：這一技術主要用于研究啟動子SNP對于mRNA轉錄效率，是通過觀察轉錄結局來判斷SNP是否具有功能。p2)EMSA技術：通過在體外合成含SNP位點的寡核苷酸與轉錄因子特異性結合，觀察結合的強度和效率,但是該技術由于只人工合成較短長度的寡核苷酸，沒有考慮SNP周圍遺傳背景環境的影響,因此在重復性和說服力上不強。p3)ChiP技術：該技術通過超聲將染色體碎片化,再將碎片化的核酸與轉錄因子的結合，最后通過PCR技術觀察判斷結合的效率和強度，該技術克服了EMSA的一些缺點,當前做的文獻較多。 SNP產生功能的機制研究的建議p1.對大多數SNP而言，都由于位于一些非編碼區域而不產生明