1、micro RNAmicroRNAmicroRNA的出現的出現?1993年，Ambros首先在Cell雜志上撰文發現了一段非編碼的單鏈小分子RNA，具有調解發育時相的作用，這是對microRNA的首次報道。近年來，Cell/Nature/Science連續把RNA的研究進展列為?十大科技突破之一?，其中最引人注目的是microRNA。?什么是什么是microRNA?microRNA?MicroRNA (miRNA) MicroRNA (miRNA) 是一類內生的、是一類內生的、長度約長度約20-2420-24個核苷酸的小個核苷酸的小RNARNA，其，其在細胞內具有多種重要的調節作用。在細胞內具

2、有多種重要的調節作用。關于關于microRNAmicroRNA的一些研究的一些研究?最近的研究表明大約 70 %的哺乳動物miRNA 基因是位于TUs區( transcription units , TUs ) ( Rodriguez et al ,2004) , 且其中大部分是位于內含子區( Kim &Nam , 2006) 。一些內含子miRNA 基因的位置在不同的物種中是高度保守的。miRNA 不僅在基因位置上保守 , 序列上也呈現出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2

3、001) 。miRNA 高度的保守性與其功能的重要性有著密切的關系。miRNA 與其靶基因的進化有著密切的聯系, 研究其進化歷史有助于進一步了解其作用機制和功能。什么是同源性？什么是同源性？?進化過程中源于同一祖先的分支之間的關系。由于進化上或個體發育上的共同來源而呈現的本質上的相似性，但其功能不一定相同，如狗的前肢和鳥的翅。從分子水平講則是指兩個核酸分子的核苷酸序列或兩個蛋白質分子的氨基酸序列間的相似程度。雖然同源性須通過序列測定來檢驗，但是DNA-DNA或DNA-RNA雜交可提供有價值的估計 。microRNAmicroRNA的存在形式的存在形式?MicroRNA存在多種形式，最原始的是p

4、ri-miRNA，長度大約為3001000個堿基；pri-miRNA經過一次加工后，成為pre-miRNA即microRNA前體，長度大約為7090個堿基；pre-miRNA再經過Dicer酶酶切后，成為長約2024nt（nt=nt=核苷酸核苷酸 nucleotidenucleotide）的成熟miRNA。DicerDicer酶酶?是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3端都有2個堿基突出。microRNAmicr

5、oRNA的特征的特征?已經被鑒定的miRNAs據推測大都是由具有發夾結構，約70個堿基大小形成發夾結構的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成的，有5端磷酸基和3羥基，大小約2125nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3端或者5端。什么叫發夾結構？什么叫發夾結構？?發夾結構（hairpin structure）：RNA是單鏈線形分子，只有局部區域為雙鏈結構。這些結構是由于RNA單鏈分子通過自身回折使得互補的堿基對相遇，形成氫鍵結合而成的，稱為發夾結構。microRNAmicroRNA的功能的功能?對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發

6、育（Reinhart 2000），細胞增殖，細胞凋亡，細胞死亡（Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003）和細胞分化（Kawasaki 2003）。此外，一個研究表明， 2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關，提示 miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關系（ Calin 2002）。然而，大多數的miRNAs的功能仍然是個迷。?microRNAmicroRNA的作用方式的作用方式?最早發現的兩個miRNAslin-4 and let-7被認為是通過不完全互補結合到目標靶mRNA 3非編碼區端，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，阻斷mRNA

7、的翻譯。?多個果蠅miRNAs也被發現和他們的目標靶mRNAs的3非編碼區有部分同源。由于miRNAs和其潛在的目標靶之間并非完全互補，這使得通過信息學的方法鑒定miRNA的目標靶位點變得困難。因而也無法確定miRNAs的作用方式是什么，以何種機制影響mRNA的翻譯，以何種方式調控基因表達。miRNAs的作用目標靶和活性機制一直是各地的研究人員的關注熱點。?研究研究microRNAmicroRNA的新工具的新工具?小分子RNA的分離：現行的RNA純化方法包括有機溶劑抽提+乙醇沉淀，或者是采用硅膠膜離心柱的方法來純化RNA。小分子RNA往往被淘汰掉，因而不適用于小分子RNA。miRNA Isol

8、ation Kit 主要采用玻璃纖維濾膜離心柱 （glass fiber filter ，GFF）方法分離。小分子RNA探針的制備：要準備目的基因的一小段寡核苷酸序列，3s端另外增加8個和T7啟動子互補的堿基，將這段寡核苷酸和 T7啟動子引物退火，用Klenow大片斷補齊得到雙鏈的轉錄模版，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和標記物混合，體外轉錄得到標記的小分子RNA探針。研究研究microRNAmicroRNA的新工具的新工具?小分子RNA的檢測;由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具，由于其分子很小，用 RT-PCR的方法來定量研究非常困難。目前多