1、石蠟切片制作一、蘇木精-伊紅對(duì)染法一、器材及試劑：1 .器材：切片刀，切片機(jī)，恒溫箱，蠟杯，酒精燈，解剖刀，解剖剪，解剖盤，培 育皿，鎰子，單面刀片，毛筆，包埋盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤，樹 膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計(jì)，臉盆，水浴鍋。切片機(jī)，切片刀，溫臺(tái)，恒溫箱，解剖刀，鏡子，解剖針，單面刀片一，小臺(tái)木, 灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。2 .試劑：中性福爾馬林固定液、各類濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、蘇木精染 液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。卡諾（Carnoy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸液，各級(jí) 酒精（

2、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）,二甲苯,甘油蛋白粘片劑，中 性樹膠。3 .材料：鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、 蠶豆的根、莖、葉等。二、實(shí)驗(yàn)原理：石蠟切片是最大體的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ) 上進(jìn)展起來的。蘇木素與伊紅對(duì)照染色法（簡(jiǎn)稱.對(duì)染法）是組織切片最經(jīng)常使 用的染色方式。這種方式適用范圍普遍，對(duì)組織細(xì)胞的各類成份都可著色，便于 全面觀看組織構(gòu)造，而且適用于各類固定液固定的材料，染色后不易褪色可長(zhǎng)期 保留。通過HE染色，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。 三、試劑配法：1 .中性甲醛固定液

3、：甲醛（37%-40%,市售，本所購買即為此濃度）100mL磷酸氫二鈉4g900mL磷酸二氫鉀（鈉） 雙蒸水2 .蘇木精、伊紅染色液為碧云天產(chǎn)品3 . 1%鹽酸乙醇液鹽酸1份70%酒精100份4 .甘油蛋白貼片劑：蛋白50 ml甘油50 ml水楊酸鈉（防腐劑）1g配制時(shí)將雞蛋一個(gè)打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀 泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時(shí)或一晚上，即可濾出透明 蛋白液。現(xiàn)在在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使二者混合。最后加入防腐劑（水 楊酸鈉）作防腐用。可保留幾個(gè)月。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1 .取材頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。切取的組織

4、塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mmX5mmX2mm或10 mmXlO mmX2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2 3加厚。注意事項(xiàng)：（1）取材動(dòng)作要迅速，不宜作太久的拖延以避免組織細(xì)胞的成份、結(jié)構(gòu)等發(fā)生轉(zhuǎn)變。（2）切片材料應(yīng)依照需要觀看的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要的部份。2 .固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，當(dāng)即投入中性福爾馬林固定液中 固定，固定30 50mino 注意事項(xiàng)：（1）一樣固定液，都以新配為宜，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以避免引發(fā) 化學(xué)轉(zhuǎn)變，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用，必然要在利用前才混合，若是混合

5、 太早，固按時(shí)就沒有作用了。（3）固定材料時(shí)，固定液必需充沛，一樣為材料塊的203。倍，有些水分多的材料，中間 應(yīng)改換1-2次新液。（4）材料固定完畢后，保留于周密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外上標(biāo)簽，并隨同材 料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以避免彼此混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo) 簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或畫圖黑墨水書寫。3 .洗滌材料經(jīng)固定后，流水沖洗，數(shù)小時(shí)或留宿。4 .脫水材料依次經(jīng)70%、80%、90%各級(jí)乙醉溶液脫水，各30min,再放入95%、100% 各2次，每次20min。各注意事項(xiàng)：（1）脫水必需在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，避免吸收空氣中的水分。（2）在改換高一級(jí)的脫

6、水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料以避免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫 水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑。（3）在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長(zhǎng)，不然易使組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體。（4）在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留的時(shí)刻也不宜太長(zhǎng)，不然會(huì)使組織變脆，阻礙切片。（5）如需留宿，應(yīng)停留在70與酒精中。（6）脫水必需完全，不然不易透明，乃至使透明劑內(nèi)顯現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象5 .透明純酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯I 15min、ni5min（至透明為止）。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，因此脫水后還要通過 二甲苯以過渡。當(dāng)組織中全數(shù)被二甲苯占有時(shí)，光線能夠透

7、過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明 狀態(tài)。透明注意事項(xiàng)（1）利用透明劑時(shí)，要隨時(shí)蓋緊蓋子，以避免空氣中的水分進(jìn)入。（2）改換每級(jí)透明劑，動(dòng)作要迅速，一方而為了不使材料塊干枯，另一方面能幸免吸收濕 氣。（3）在透明進(jìn)程中，若是材料周闈顯現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒 精中從頭脫水，然后再透明。6 .透蠟放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min （有嗎？）,再放入石蠟I、石蠟H 透蠟各50-60分鐘。透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程 度以便包埋。透蠟時(shí)刻依照組織大小而定。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并維持箱內(nèi)溫度在 55-60C左右，注意溫度不要太高，

8、以避免組織發(fā)脆。一樣置于恒溫箱。透蠟注意事項(xiàng)（1）盡可能維持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度；（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低：（3）操作要迅速，力求在最短的時(shí)刻內(nèi)完成石蠟透入進(jìn)程，以避免引發(fā)組織變硬、變脆、 收縮等。7 .包埋包埋時(shí)，用鎰子夾取石蠟?zāi)Ｐ停ń饘儋|(zhì)地）在酒精燈上略加熱，放在平的 桌面上，從溫箱中掏出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少量石蠟。再將鐐子在酒精燈上 略加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)Ｖ校帕姓R。再放上包埋盒，輕輕倒入 熔蠟。8 .切片將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口切近，但不可超過刀口。調(diào)整石蠟塊與刀口

9、之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。調(diào)整厚度調(diào)劑器到所需的切片厚度，一樣為4-10微米。一切調(diào)整好后主能夠開始切片。現(xiàn)在右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持 毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-50r/min。切成的蠟帶到20-30cm長(zhǎng)時(shí)，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以避免卷曲， 并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較滑膩，朝下，較皺的一面朝上。 用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀 看切片是不是良好。切片工作終止后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭 干凈妥為保留。9 .展片、貼片打開水浴鍋，使水溫維持在40-

10、45,另預(yù)備30%乙醇溶液。切片時(shí).，將一碗30%乙醇溶液放于切片機(jī)旁的桌面上。用小鐐子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。 小鐐子輕輕地將連在一路的切片分開，用一個(gè)載玻片將切片完整，已展開的切 片撈至溫水中，使之充分展開。另取干凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊, 粗糙的一端）磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽，放于切片架上。10 .脫蠟復(fù)水將水浴鍋溫度調(diào)至60,待水溫操縱在60時(shí)，將切片連同切片架放入一 干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30min至蠟熔化。以后，石蠟切片經(jīng)二甲苯I、H脫蠟各5min,然后放入100%、95%、90%、8

11、0%、70%各級(jí)酒精溶液中各3-5min,再放入蒸鐳水中11 .染色切片放入蘇木精中染色約10-30mino染色時(shí)刻應(yīng)依照染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)。室溫高時(shí)增進(jìn)染色, 染色時(shí)刻可短些，不然可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)刻，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。12 .水洗用自來水流水沖洗約15mino使切片顏色變藍(lán)（或放入堿性水中也可），但 要注意流水不能過大，以防切片脫落。13 .分化將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數(shù)十秒鐘。見切片變紅，顏色 較淺即可。14 .漂洗切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。15 .脫水I切片入50%乙醇f 70%乙醇f 80%乙醇中各3-5mino 1六、復(fù)染用

12、伊紅乙醇液對(duì)照染色l-3mino伊紅要緊染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，若是細(xì)胞核染色較 濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以取得鮮明的對(duì)照。反之，若是細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染。 可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染,促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，而且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色。 17.脫水H將切片放入95%乙靜中洗去多余的紅色，然后放入無水乙靜中3-5mino最 后用吸水紙吸干多余的乙醇。18 .透明切片放入二甲苯I、II中各3-5mino二甲苯應(yīng)盡可能維持無水，應(yīng)常常改換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水 分。切片如在二甲苯中顯現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醉中從頭脫水，不然切片難 以鏡

13、檢。19 .封藏：中性樹膠封存因切片經(jīng)二中苯透明，利用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至 適合的稠度。封藏的方式：封片前應(yīng)依照材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，在桌上放一張干凈的 吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中掏出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的 中央滴一滴樹膠（萬萬不能待二甲苯干燥后再進(jìn)行），用右手持小銀子輕輕地夾住蓋玻片的 右邊，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，如此就能夠夠減少或 幸免產(chǎn)動(dòng)氣泡。如膠液不足，能夠用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補(bǔ)足。如膠液過量，可 在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木

14、素染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。二、免疫組化染色1 .石蠟切片，步驟同前。切片經(jīng)貼片后，60c烤片30min使蠟熔化，經(jīng)二甲苯 I、II各lOmin,脫蠟。然后，將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min, 再放入蒸鐳水中3min,水化。2 .脫蠟和水化后，用PBS,具體看所用抗體及染色試劑說明)沖洗3次，每次3 分鐘。洗瓶沖洗。3 .依照抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。可選步驟，具體見抗體說明 書。4 .每張切片加1滴或50 口1 3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過 氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶含 量高的組織而言。5 .除去PBS液，每張切片加1滴或50 u 1的第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4 留宿，具體參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次，每次3分鐘。6 .除去PBS液,每張切片加1滴或50 P 1即用型MaxVisio