1、題目：小鼠細(xì)胞染色體染色觀察Objectives:1. Learn the method of preparation of mouse chromosome from marrow.學(xué)習(xí)制備從骨髓中制備小鼠染色體的方法。2. Understand the morphology and amount of mouse mitotic.了解小鼠有絲分裂期細(xì)胞染色體的形態(tài)和數(shù)量。二實(shí)驗(yàn)原理1. 秋水仙堿，一種生物堿，因最初從百合科植物秋水仙中提取出來，故名，也稱秋水仙素。純秋水仙堿呈黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)157 C。易溶于水、乙醇和氯仿。味苦，有毒。秋水仙堿能抑制有絲分裂， 破壞紡錘體，使染色體停滯在

2、分裂中期。這種由秋水仙堿引起的不正常分裂，稱為秋水仙堿有絲分裂。在這樣的有絲分裂中，染色體雖然縱裂，但細(xì)胞不分裂，不能形成兩個(gè)子細(xì)胞，因而使染色體加倍。2. 現(xiàn)今微絲標(biāo)記方法分為在細(xì)胞中標(biāo)記微絲和活體細(xì)胞中標(biāo)記微絲。固定細(xì)胞中的微絲主要是用帶熒光探針的抗體或鬼筆環(huán)肽標(biāo)記， 需要對(duì)樣品進(jìn)行 化學(xué)固定和膜的通透。活體標(biāo)記常采用熒光類似 物標(biāo)記的方法和GFP標(biāo)記方法。三. 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備1. 實(shí)驗(yàn)材料：a）秋水仙素稀釋液b）小鼠一只c）75mM KCI低滲溶液d）固定液e）Giemas 染液2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：a）普通光學(xué)顯微鏡b）載玻片若干，注射器。c）酒精燈d）離心管若干、吸水紙、滴管、剪刀、白瓷板

3、等四. 實(shí)驗(yàn)方法及步驟1. 提前3-4h向小鼠腹腔中注射秋水仙素，然后用引頸法處死 小鼠。2. 完整取出小鼠股骨（脛骨），取出骨骼表面肌肉和其他結(jié)締 組織。3. 將脛骨兩端剪開，用注射器吸取適量75mMKCI將骨髓沖洗 到離心管中。4. 低滲處理：用約6ml的75mM KCI在37C下低滲骨髓細(xì)胞20mi n。5. 預(yù)固定：加入1-2ml新配制的固定液，用吸管混合均勻， 1000r/min離心8分鐘6. 固定：吸去上清液，沿離心管壁緩緩加入6ml固定液，立即用吸管吹打成細(xì)胞懸液，在室溫下靜置固定15min。然后，1000r/min離心8分鐘。重復(fù)該步驟一次。7. 制細(xì)胞懸液：吸去上清液，加入

4、0.3-0.5ml固定液，用吸 管吹打成細(xì)胞懸液。8. 制片：用吸管吸取上述細(xì)胞懸液，在距離載玻片約40cm高 度將適量細(xì)胞懸液（根據(jù)濃度）滴在在載玻片上，在酒精 燈上威威加熱，使載玻片完全干燥。9. 染色：新配置的 Giemsa染液染色10-15min，自來水緩緩 沖洗，干燥。（不要傾倒染色液，避免染色液氧化膜黏附。）10. 鏡檢：低倍鏡下找到處于中期分裂相的染色體，高倍鏡油鏡下觀察。五. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1小鼠骨髓干細(xì)胞染色體制片 ，100倍光鏡下可見被染成紫色的細(xì)胞內(nèi)容物，其中紫色細(xì)小棒狀的為小鼠染色體，紫色圓球狀的為細(xì)胞核。染色體分離狀況有很大差別，如下圖J。查詢資料可知 是因?yàn)榈蜐B溶液處理

5、的效果不同導(dǎo)致的，可見19對(duì)+X+Y共40條染色體。小鼠為雄性。圖2不同分離程度的染色體六. 實(shí)驗(yàn)討論1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)使用低滲處理技術(shù)使小鼠染色體分散良好，再經(jīng)過Giemas染液充分染色，能清晰觀察到小鼠細(xì)胞染色體組。觀察結(jié)果為19對(duì)+X+Y共40條染色體。且經(jīng)過多次觀察統(tǒng)計(jì)與染色體配 對(duì)，該觀察結(jié)果真實(shí)有效。2. 討論一：根據(jù)你對(duì)染色體的觀察 結(jié)果，你所用的小鼠是雌性還是 雄性？觀察結(jié)果中可見小鼠染色體組中有丫染色體，所以該小鼠為 雄性3. 討論二：根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，小鼠 有多少條染色體？如何保證你的 數(shù)據(jù)是真實(shí)有效的?根據(jù)我的觀察結(jié)果，小鼠有 40條(20對(duì))染色體。數(shù)據(jù)有效的證據(jù)：

6、(1) 在對(duì)玻片上10個(gè)以上清晰可見的單個(gè)細(xì)胞小鼠染色體分布區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，雖然有部分細(xì)胞可見染色體數(shù)少于40，但沒有多于40條的情況發(fā)生。可基本排除偶然性造成的影響。(2) 根據(jù)染色體的長度、形態(tài)和著絲粒位置進(jìn)行配對(duì)， 除性染色 體組差異較大外，其他染色體均可找到它的同源染色體。證明這是一套完整的染色體組。4. 討論三：假設(shè)某病人有血液腫瘤，需要分析其染色體，你 該如何取材制備染色體標(biāo)本以分析其染色體水平的變化？分析染色體組需要標(biāo)本保留分裂能力并且處于細(xì)胞分裂期，常用的取樣部位有骨髓、 外周血淋巴細(xì)胞、生殖腺、羊水；考慮到 病人的實(shí)際情況，可選用取用外周血淋巴細(xì)胞的方法。外周血淋巴細(xì)胞在正常條件

7、下不具有有絲分裂的能力，但是在植物凝集素(PHA刺激下，能轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹至涯芰Φ哪讣?xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟包括1.抽取靜脈血2.置于加入了 PHA的胎牛血清培 養(yǎng)基中培養(yǎng)72h 3.離心、固定、染色等制片步驟。5. 討論四：在動(dòng)物中，血液是制備染色體標(biāo)本的重要材料來 源，但并不是任何情況下都是這樣。有的情況下需要用其 他組織來源的細(xì)胞制備染色體，請舉例說明。制備染色體的關(guān)鍵是能制備處于分裂期的細(xì)胞，如果因?yàn)榉N種原因無法從血液中分離到能誘導(dǎo)產(chǎn)生分裂能力的細(xì)胞，則需要從其他組織中制備染色體。可能的原因有：(1) 動(dòng)物沒有血液，如線蟲動(dòng)物門，部分軟體動(dòng)物門。(2) 血液中無法誘導(dǎo)出有分裂能力的細(xì)胞，如部分昆蟲(3) 血液細(xì)胞不進(jìn)行有絲分裂，如蛙的紅細(xì)胞。七. 參考文獻(xiàn)1 DOS REMEDIOS CG, CHHABRA D, KEKIC M, et al. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilam