1、地高辛標記系統探針的標記地高辛標記系統地高辛標記系統常用標記物分類n放射性同位素標記n非放射性標記熒光素標記生物素標記地高辛標記地高辛標記系統n地高辛（DIG）是靈敏度高、非放射性核酸標記檢測體系。DIG檢測靈敏度接近同位素而無放射性危險、相比熒光則不需要特殊檢測設備，相比生物素則沒有樣本內源干擾之苦，很適合用于核酸非放標記檢測。 地高辛標記系統地高辛標記的dUTP地高辛標記系統地高辛標記系統的特點n標記和檢測技術安全n標記的探針穩定可以保存一年n雜交液可以反復使用數次地高辛標記系統與放射性同位素標記方法相同之處n標記和雜交技術相似n高靈敏度n低背景n可以標記DNA、RNA 或Oligonuc

2、leotides地高辛標記系統與放射性同位素標記方法不同之處n無害,安全n產生的廢物不需特殊處理n需要分析的時間短n探針穩定地高辛標記系統地高辛標記與檢測的原理n利用不同的方法將Digoxigenin-11-dUTP摻入到新合成的探針DNA 或RNA鏈中或寡核苷酸的末端n探針與目標DNA雜交后，用連接有堿性磷酸酶或其它偶聯物的地高辛的抗體檢測地高辛標記的探針n根據地高辛抗體連接的偶合物不同，利用熒光檢測（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化學發光檢測(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或顯色（anti-DIG-AP and NBT/

3、BCIP or other substrates)的方法將探針雜交的位置顯現出來地高辛標記系統地高辛標記系統n利用隨機引物標記的方法將 Digoxigenin-11-dUTP摻入到新合成的DNA 鏈中。n反應體系中包含六堿基隨機引物、dNTP(含有堿性條件下不穩定的Digoxigenin-11-dUTP，Klenow 酶及反應所需的Buffer隨機引物標記地高辛標記系統nDIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3n20-25bp 可插入一個DIG-dUTPn隨機引物法標記的探針是基于模板的不同區段、不同長度的DNA 片段n可以探測0.03-0.1pgDNA地高辛標記系統DNA的地高辛標記和檢測

4、步驟n探針DNA 的標記及標記效率測定nDNA的轉移和固定n雜交n免疫測定n洗去膜上探針再次雜交地高辛標記系統操作基本要求n工作環境及試劑要干凈：（1）試劑要高壓滅菌；（2）含有SDS 的試劑要過濾滅菌；（3）TWEEN20應加到預先滅菌過的試劑中n用具要干凈：用之前一定要清洗得非常干凈n操作尼龍膜時要小心（1）戴無塵手套；（2）用干凈的鑷子夾取膜的邊緣地高辛標記系統探針模板DNA的要求n質粒DNA純度要高。最好用高純度的質粒DNA 分離和純化試劑盒純化質粒模板或用苯酚/氯仿抽提去除殘留的蛋白質。純化后的模板用H2O 溶解n用作探針模板的DNA應是線型的，大于100bp，如果模板DNA 5kb

5、則應用4堿基的限制性內切酶切割成較小片段（切割后要純化）n模板的量：10ng-3g，如果要檢測復雜基因組中的單拷貝基因，標記模板的最低量要300ng（探針濃度：25ng/ml雜交液）n如果做基因組DNA southern blotting, 應將克隆倒載體上的DNA 酶切后瓊脂糖電泳分離或PCR擴增，得到的片段都需要用試劑盒純化地高辛標記系統標記步驟(20l)n將10ng-1g 模板DNA用無菌去離子水補足至16 l。n沸水浴或干浴98 C 10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。n充分混勻DiG-high Primer （1#管），并取4 l至變性DNA管，混勻并離心。n37 C溫育1小

6、時或過夜（最大到不超過20小時）。n停止反應，加2 l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 C加熱10分鐘。地高辛標記系統本次實驗標記步驟(10l)n將300ng 模板DNA用無菌去離子水補足至8 l。n沸水浴或干浴98 C 10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。n充分混勻DiG-high Primer （1#管），并取2 l至變性DNA管，混勻并離心。n37 C溫育1小時或過夜（最大到不超過20小時）。n停止反應，65 C加熱10分鐘。地高辛標記系統探針標記效率檢測n目的是確定雜交中使用正確的探針量，探針用量太多會引起背景太深，用量太少則無雜交或雜交很弱（探針濃度：25ng/ml

7、雜交液）地高辛標記系統檢測流程n將地高辛標記好的探針系列稀釋，點到一條尼龍膜上，同時用地高辛標記的control DNA作對照標準，120C固定30分鐘；n用地高辛抗體免疫檢測，按BNT/BCIP顯色步驟顯色；n比較顯色結果，選擇帶有可以接受的背景的最高探針濃度做正式的雜交。地高辛標記系統試劑準備（1）nWashing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25 stable. Removal of unbound antibody.nMaleic acid buffer: 0.1M Ma

8、leic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20)0 15-25 stable. Dilution of Blocking solution.nDetection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20). 15-25 stable. Ajustment of pH to 9.5. nTE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25 stable. Stopping color reaction.地高辛標記系統試劑準備（2）nB

9、locking solution :用Maleic acid buffer 10稀釋試劑6#（10Blocking solution ），成1的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10Blocking solution 混勻，現配現用。封閉膜上非特異性結合位點nAntibody solution(Ab) solution : 將4#試劑離心，按1：5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 C可放12小時。（每10ml Blocking solution 加1ul Ab抗體即可）.與地高辛標記的探針結合。nColor-substra

10、te solution（顯色液）：從試劑5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光，現配現用。顯示抗體結合的位點地高辛標記系統Dig-High Prime DNA標記及檢測試劑盒理想條件下標記產量Template DNA1 h20 h10 ng45 ng600 ng30 ng130 ng1050 ng100 ng270 ng1500 ng300 ng450 ng2000 ng1000 ng 850 ng2300 ng3000 ng1350 ng2650 ng地高辛標記系統探針定量n根據上表探針標記的理想產量將標記的探針稀釋到1ng/l. 例如：起始

11、模板用1g，20l體系1h 后，查前表可知其理想標記量是850ng，則探針的理想標記濃度為850ng/20 l =42.5ng/l; 則取1l標記產物+41.5l H2O 混勻后即得到1ng/l探針稀釋液. n將試劑盒提供的control DNA稀釋到1ng/l (原始濃度是5ng /l)地高辛標記系統Tube From tube#DNA (l)DNA dilution buffer(l)Dilution Final concentration1Diluted orginal1ng/l2121981:10010 pg/l3215351:3.33 pg/l425451:101 pg/l53545

12、1:100.3 pg/l645451:100.1 pg/l755451:100.03 pg/l865451:100.01 pg/l9-050-0地高辛標記系統步驟n將上述稀釋的2-9 號管的control DNA 及探針DNA各取1l點膜n120C固定30分鐘或紫外交鏈n將膜放入裝有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室溫2分鐘n將膜放入10ml Blocking solution中室溫溫育30分鐘n將膜放入10ml Antibody solution 中室溫溫育30分鐘n用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分鐘n在10ml Detection

13、buffer 平衡2-5分鐘n將膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室條件下顯色。顯色過程中不要搖動。n當斑點或帶顯示出來后，用50ml滅菌的雙蒸水洗膜5分鐘，照相地高辛標記系統定量結果分析染色至0.1pg的Control DNA出現斑點，比較標記的探針與Control DNA 染色情況計算出地高辛標記的DNA 的量。u如果0.1pg的探針及對照稀釋點都顯色，則探針標記理想u如果0.1pg的對照顯色， 0.1pg的標記探針沒顯色，但0.3pg顯色，則計算探針濃度（約為理想濃度的1/3）以確定雜交時加多少探針（25ng探針/ml雜交液）u如果0.1pg的對

14、照顯色，但標記探針0.3pg的斑點沒顯色，則應重新標記探針地高辛標記系統探針標記效率低的原因及解決辦法1. 標記條件不合適u重新標記，但將標記時間延長至過夜u用相同量的模板標記，但體系放大，體系中的其它成分相應放大u模板放在沸水中變性2. 模板不純只用高純度模板用推薦的試劑盒準備模板純化模板：用苯酚/氯仿抽提后用酒精沉淀地高辛標記系統DNA 的轉移和固定n固定：2 的SSC短暫洗滌膜后 120C 30 min 或80C 2h；或者將膜放在用10 的SSC 浸濕的濾紙中UV-Crosslinkeringn不馬上使用的尼龍膜放在2-8 C干燥保存地高辛標記系統預雜交注意事項n預雜交的目的是用非特異

15、性DNA分子（鮭精DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點封閉，從而減少雜交背景。n預雜交及雜交時保證buffer覆蓋膜n如果尼龍膜要多次探測，務必保證在任何時候都不要讓尼龍膜干燥地高辛標記系統雜交液組成雜交液組成5SSC (NaCl，檸檬酸鈉，檸檬酸鈉)50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4)5Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA)2.5mmEDTA （有（有/無）無）100ug/ml SS DNA (鮭精鮭精DNA)0.1%SDS10%硫酸葡聚糖（硫酸葡聚糖（dextran sulfate）地高辛標記系統雜交液的準備

16、和雜交溫度的計算nDiG Easy Hyb：將64ml 無菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶（DiG Easy Hyb Granules)，37 C搖動溶解5分鐘n計算雜交溫度：通常為37 C -42 CnTm=49.82+0.41(%G+C)- (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)。nTopt.=Tm-20 to 25 C地高辛標記系統雜交n預熱一定體積的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至雜交溫度37-42 C 。n預雜交30分鐘。在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中42 C下充分潤濕。（此過程可以延長至數小時）n變性：Dig

17、標記的探針（約25ng/ml）加50l H2O置沸水浴或98 C干浴鍋中5分鐘后迅速放在冰上冷卻。（不能用堿變性！）n將變性的探針加入預熱的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫。n倒出預雜交液，加入探針和DIG Easy Hyb混合液。n繼續在42 C下雜交6h 至過夜（單拷貝探針）。地高辛標記系統備注：n含有探針的DiG Easy Hyb雜交液可重復利用，雜交結束后放入離心管中于-20 C保存，可重復使用幾次，只需在使用前于68 C處理10分鐘即可n不要煮沸DiG Easy Hyb雜交液地高辛標記系統雜交時注意事項n使用正確的雜交溫度（使用DIG EasyH

18、yb，DNA：DNA3742C，RNA：RNA 68C，RNA：DNA 50C）n為防止尼龍膜干燥，在準備好下一步處理用試劑之前不要倒掉正在用的溶液n使用合適的探針濃度n探針用之前68C 變性地高辛標記系統洗膜n2SSC，0.1%SDS室溫下洗滌5分鐘，洗2次。n0.5SSC，0.1%SDS 65-68溫和搖動15分鐘，洗2次。地高辛標記系統雜交后洗膜時注意事項n如果探針與靶DNA 的同源性低于80%，熱洗時應使用較低的溫度（如60C）n熱洗之前應將洗膜液預熱到熱洗所需溫度地高辛標記系統免疫檢測n試劑準備同探針標記效率測定n所有反應在15-25C進行并輕輕搖動，n如果膜需再次使用，任何時候都不

19、要讓膜干燥地高辛標記系統試劑準備（1）nWashing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25 stable. Removal of unbound antibody.nMaleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20)0 15-25 stable. Dilution of Blocking solution.nDetection buffer: 0.1M Tri

20、s-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20). 15-25 stable. Ajustment of pH to 9.5. nTE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25 stable. Stopping color reaction.地高辛標記系統試劑準備（2）nBlocking solution :用Maleic acid buffer 10稀釋試劑6#（10Blocking solution ），成1的工作液，即每9ml 1Maleic acid buffer中加入1ml 10Blocking solution 混勻，現配

21、現用。封閉膜上非特異性結合位點nAntibody solution(Ab) solution : 將4#試劑(Anti-Digoxigenin-AP Conjugate)離心，按1：5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 C可放12小時。（每10ml 1Blocking solution 加1ul Ab抗體即可）.與地高辛標記的探針結合。nColor-substrate solution（顯色液）：從試劑5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光，現配現用。顯示抗體結合的位點地高辛標記系統操作步驟（室溫下進行）n1雜

22、交和洗膜后，用Washing Buffer( Buffer1)浸泡1-5分鐘n2在50-100ml 1Block solution（Buffer2）中處理30分鐘n3用1Block solution（Buffer2）稀釋抗體DIG-抗原偶聯物至150mU/ml（1:5000）n4用20ml antibody solution處理膜30分鐘n5用50-100ml Washing Buffer( Buffer1)洗膜15分鐘，洗2次n6在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5分鐘n7在10ml 新鮮配制的color substrate solution中處理膜5分鐘，放在塑料袋