1、RNA干擾抑制HepG2細胞AFP基因表達實驗方法建立 作者：張國英 楊慧 劉明社 張蕓 趙中夫【關鍵詞】 陽離子脂質體META;HepG2細胞;RNA干擾;AFP 摘 要 目的:篩選較理想的陽離子脂質體META/pGenesil-AFP質粒轉染HepG2的方法。方法:將針對兩條靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板雙鏈，連接于質粒表達載體，構建質粒載體pGenesil-1-AFP1（含綠色熒光蛋白GEP編碼序列）及pGenesil-2-AFP2，用陽離子脂質體META/質粒載體pGenesil-1-AFP1轉染HepG2細胞。熒光顯微鏡觀察并計算不同劑量配比的脂質體/質粒載體混合液

2、轉染效果及微粒子化學發光免疫分析法檢測不同劑量配比轉染后對AFP基因表達的影響。結果:劑量比為8L2.5g條件，能有效地轉染HepG2細胞，并有效抑制AFP表達且無細胞毒性作用。結論:本研究成功建立了陽離子脂質體META/質粒載體pGenesil-1-AFP1轉染HepG2細胞實驗方法。 關鍵詞 陽離子脂質體META;HepG2細胞;RNA干擾;AFP 近年來發現的RNA干擾技術（RNAi）被認為是最有效基因敲除方法。實施siRNA對靶序列的抑制，成功地將雙鏈RNA轉染到細胞內是實驗的關鍵。本研究將針對兩條靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板雙鏈，連接于質粒表達載體，構建質粒載體p

3、Genesil-1-AFP1（含綠色熒光蛋白編碼序列）及pGenesil-2-AFP2，用陽離子脂質體META/質粒載體pGenesil-1-AFP1對HepG2細胞進行了轉染實驗研究，擬篩選較理想的陽離子脂質體META/pGenesil-1-AFP質粒轉染HepG2的方法。2 / 13 1 材料與方法 1.1 材料 高糖型DMEM培養基由美國GIBCO公司提供;胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供;L-谷氨酰胺由北京化學試劑公司提供;META-FECTENE轉染試劑由德國BIONTEX提供;質粒載體pGenesil-1-AFP1、pGenesil-2-AFP2由武漢晶賽生物工程有限公司協助合

4、成;AFP化學發光免疫分析試劑盒由美國BECKMEN提供;人肝癌細胞HepG2由北京大學感染科病毒研究室惠贈，本室傳代。 1.2 方法 1.2.1 目標基因序列的選擇及載體構建:以人肝癌細胞HepG2細胞AFP基因作為作用靶點（geneID:174），合成兩條AFP-shRNA，分別為AFP-1，AFP-2，經BLAST軟件查對及序列同源性分析，確定目標基因序列為:AFP-1:1275i-GCATTG-GCAAAGCGAAGCT-，AFP-2:694i-GCAGCU-UGUUAAAUCAACA-陰性對照（HK）:-GACTTCATAAGGCGCATGC-，構建質粒載體pGe-nesil-1-A

5、FP1插入的DNA模板序列（包含GFP編碼 序 列）:5- GATCCGCATTG-GCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTT-GCCAATGCTTTTTTGTCGACA-3，3-GCGTAAC-CGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAAC GGTTACGAAAAAAC AGCTGTTCGA-5，構建質粒載體pGenesil-2-AFP2插入的DNA模板序列為: 5 - GATCCGGTCTTACA-TAAGAGGACTTTCAAGACGAGTCCTCTTATGT AA-GACCTTTTTTGTCGACA-3，3-GCCAGAATG-TATTCT

6、CCTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATT CTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5，構建質粒載體pGenesil-2-HK插入的DNA模板序列為:5-GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACG-GCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3，3-GCTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCC GTACGCGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5，載體質粒的構建及酶切鑒定、DNA序列分析由武漢晶賽生物工程公司協助完成，濃度為2.5g/L。 1.2.2 待轉染HepG2細胞的培養和準備:Hep

7、G2細胞生長于含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養基中，并在37、5%CO 2 孵箱中進行培養。轉染前選擇對數生長期細胞，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后吹打成單細胞懸液，以4×10 5 密度轉種于放置了無菌蓋玻片的6孔培養板中，每孔2mL。24h后觀察細胞生長，鋪滿孔底面積約60%時用于轉染。 1.2.3 轉染試劑META/質粒載體混合液配制及轉染:劑量配比在其建議范圍（2171）內選擇設計，按META/pGenesil配比分六組，分別為空白對照組，3L1g組，6L1g組，8L2.5g組，12L2.5g組，15L5g組，每組設三個復孔。用pGenesil-1-EGFP-A

8、FP1進行實驗，以便熒光顯微鏡下觀察轉染效果。 取10支無菌1.5mL EP管，作好標記:取9L，18L，24L，36L，45L脂質體分別加入A1，A2，B1，B2，C1管中;迅速加入無抗生素無血清的DMEM培養基，使得各管中總體積為300L，輕輕混勻。a1，a2管中各加1.2L pGenesil-1-EGFP-AFP1;b1，b2管中各加3L;c1管中加6L;然后各管中迅速加入無抗生素及血清的DMEM培養基，使得各管中總體積為300L，混勻。將管A1、A2、B1、B2、C1中的脂質體對應加入a1、a2、b1、b2、c1管中，輕輕混勻。室溫下靜置20min。取出培養板將板中培養液棄去，用無血清

9、及抗生素的DMEM培養基沖洗培養板兩次后，留出三孔作為空白對照，每孔加1mL無血清及抗生素的DMEM培養基，其余各孔各加0.8mL。除空白對照外，每三孔加入相同劑量配比的META-pGene復合物各200L，混勻。將培養板置于CO 2 孵箱中培養8h后，吸出孔中DMEM，每孔加入含10%胎牛血清的完全DMEM繼續培養。培養24h后吸出細胞培養上清液，將蓋玻片用PBS洗滌兩次后置于熒光顯微鏡下觀察，記錄不同劑量配比的轉染效果。 1.2.4 細胞培養上清液中AFP的檢測:轉染后24h，對各孔AFP進行檢測。采用微粒子化學發光免疫分析法，美國BECKMEN公司試劑盒操作。2 結果 2.1 不同劑量配

10、比的META/質粒載體混合液轉染效果熒光顯微鏡下，我們觀察到不同劑量配比的陽離子脂質體有不同的轉染效果，表達綠色熒光蛋白的為被轉染細胞。為了計算不同配比陽離子 META的轉染率，在不同配比的轉染組的蓋玻片上 各選擇3個視野，計數細胞，計算陽性細胞的平均百分率。以此篩選RNAi實驗的最適META/質粒載體比例。見表1。表1 不同配比脂質體轉染試劑轉染率（略）在不同配比試劑的轉染組中，8L2.5g組和12L2.5g組轉染效率較高，且兩者之間無顯著性差異（P>0.05）;但顯著高于3L1g組和6L1g組（P<0.01）。因15L5g組多數細胞發生崩解呈碎片樣，無法觀察到轉

11、染效果，未列入統計表中。 2.2 不同劑量配比組轉染后對AFP基因表達的影響 轉染后24h，對各孔AFP進行檢測，結果顯示與轉染率相一致的抑制作用，3L1g組和6L1g組與不做轉染的空白對照組相比，AFP含量無顯著性變化。8L2.5g組與12L2.5g組的AFP含量無明顯差別（P>0.05），但均較空白對照組和低濃度組減少（P<0.01）。見表2。 表2 不同配比轉染組對AFP表達的影響（略） 根據以上實驗結果，我們選用劑量配比為8L2.5g的META/質粒載體混合液為最佳條件配比。 3 討論 哺乳動物細胞基因轉染有多種方法 1 ，在早期siRNA研究中多應用磷酸鈣

12、共沉淀法，但此方法轉染效率低且對很多細胞株無效。以后有人利用陽離子脂質體在水中可形成微小的帶正電的單層脂質體，靠靜電作用結合到核酸分子的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面，被俘獲的核酸分子就會被導入細胞原理，采用陽離子脂質體法進行轉染研究，此方法雖操作簡便，轉染效率高，但易產生高水平細胞毒性 2 。近幾年出現的新一代脂質體多聚陽離子脂質體，可以濃縮DNA，將DNA運送到細胞內并使其在細胞核內釋放，而且細胞毒性低，穩定性好，轉染效率高（可達磷酸鈣沉淀法的5倍100倍）。本實驗中，我們將編碼siAFP的DNA模板插入pGenesil-1質粒載體，構建出pGenesil-1-AFP。這種質粒以pEGF

13、P-C1改造獲得，用陽離子脂質體包裹質粒載體轉染細胞后，被轉染細胞可以表達綠色熒光蛋白。在熒光顯微鏡下可以直接觀察到轉染成功的陽性細胞發出明亮綠色熒光。通過計數視野中陽性細胞和總細胞數可以計算出轉染率。結果發現，不同劑量的轉染試劑能將不同濃度比例的質粒載體轉入細胞，以轉染試劑:質粒載體為8L2.5g組與12L2.5g組的轉染組轉染效率最高，均可達到50%左右，兩組轉染效率無顯著差異，但后者細胞活性明顯下降，而增加轉染試劑濃度比值至15L5g組中的細胞則發生溶解，說明多聚陽離子脂質體劑量過大也可能對細胞產生毒性作用。提示劑量比為8L2.5g條件，能有效地轉染HepG2細胞，且無細胞毒性作用。 甲

14、胎球蛋白（AFP）是人類發現的第一個真正有價值的腫瘤標志物，長期以來，一直認為AFP僅可用于原發性肝癌（HCC）的診斷。近年來，隨著分子生物學技術、免疫學技術及細胞間信號轉導研究的發展，有關學者通過實驗證實AFP有促進腫瘤細胞增殖的重要生物學作用 3，4 。RNAi能高效、特異、持久抑制基因表達，對由于基因表達異常增 高引起的疾病中有重要的應用前景。先前應用RNAi技術抑制有關基因表達的實驗，大多采用體外轉錄合成siRNA或構建siRNA表達載體與靶基因表達載體共同轉染目標細胞的方法，單獨觀察靶基因表達受抑效果，這種方法雖可以準確檢測到siRNA特異地抑制基因表達作用 2，5，6 。但目前的轉

15、染方法并不能保證試驗體系中所有細胞均被轉染，不符合活體內發生腫瘤的自然狀態。因此，試驗結果距應用研究還有一定差距。本研究以HepG2細胞為研究對象，使轉染和未被轉染的細胞在同一體系中培養，在轉染效率達50%左右后，不去除未被轉染的細胞，觀察AFP基因表達抑制情況。這種試驗方案不僅比較接近機體發生腫瘤的自然狀態，而且可以更好地評價siRNA特異地抑制AFP基因表達的作用。 參考文獻 1 Shlomai A，Shaul Y.Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interferenceJ.Hepatolo

16、gy，2003，37（4）:764 770. 2 Giladi H，Ketzinel-Gilad M，Rivkin L，et al.Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in miceJ.Molecular Thera-py，2003，8（5）:769776. 3 Li MS，Li PF，He SPet al.Promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel7402line cellsJ.World Gastrunal，2002，8（3）:467472. 4 康曉燕，殷正豐，錢海華，等.肝癌患者外周血甲胎蛋白異質體和轉