1、人類Foxm1b基因的原核表達、抗體制備及其對肝癌細胞中Foxm1b蛋白的識別 作者：唐保東， 劉思純， 徐雅， 曾志榮， 胡品津【摘要】 【目的】 構建人類Foxm1b基因的原核表達載體，表達并純化蛋白，制備多克隆抗體，并用此抗體檢測肝癌細胞中Foxm1b基因的表達，為進一步研究Foxm1b基因的功能奠定基礎。【方法】 從GenBank中下載人類Foxm1b基因全長cDNA序列并用Pcgene軟件分析其可能的抗原表位，設計引物，應用RT-PCR獲得含抗原表位的Foxm1b基因片段，重組入原核表達載體pET-28a，在大腸桿菌BL-21(DE3)中誘導表達，應用親和層析法獲得純度較高的原核表達

2、蛋白并免疫大鼠制備多克隆抗體，用ELISA檢測抗體滴度并用免疫細胞化學的方法檢測此抗體對肝癌細胞中天然Foxm1b蛋白的識別。【結果】 成功構建了Foxm1b基因重組表達載體pET-28a-Foxm1b，表達的蛋白經純化后免疫大鼠得到了高滴度的多克隆抗體，該抗體可以識別肝癌細胞中的天然抗原。【結論】 人類Foxm1b基因的原核表達載體的構建、重組蛋白的表達純化及有診斷價值的抗體的制備為后續的研究提供了基礎。 【關鍵詞】 人類Foxm1b基因； 原核表達； 多克隆抗體； 肝癌細胞1 / 15 Abstract:【Objective】 To construct prokaryotic recomb

3、inant plasmid and express Foxm1b protein, prepare its polyclonal antibody and apply it to recognize the nature antigen in liver tumor cell line. 【Methods】 The full cDNA sequence of human Foxm1b gene was obtained from GenBank and analyzed by PCgene bioinformatics software to investigate the antigenic

4、 determinants. The sequence containing antigenic determinants of human Foxm1b gene was amplified by RT-PCR and recombined into prokaryotic expression vector pET-28a, then transformed into E.coli BL-21(DE3). After induced by IPTG, the recombinant protein was expressed and purified by affinity purific

5、ation. The polyclonal antibody was obtained from rats immunized by the recombinant protein and was identified by ELISA. Immuocytochemistry was used to affirm that the polyclonal antibody could recognize the natural Foxm1b protein expressed in liver tumor cell.【Results】The recombinant prokaryotic exp

6、ression vector pET-28a-Foxm1b was constructed and the recombinant protein was purified successfully, and the prepared high titer polyclonal antibody could recognize the natural protein in liver tumor cell very well.【Conclusions】 The recombinant prokaryotic expression vector, the recombinant protein

7、and the polyclonal antibody obtained successfully in this study would be applied for further investigation of the Foxm1b gene and liver cancer. Key words：Human Foxm1b gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; liver tumor cell 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一。我國每年約23萬人死于肝癌，占全球

8、肝癌患者死亡數的53。許多研究表明，癌細胞的生長、轉移同某些基因有關1。Foxm1b是一種上調細胞增殖的轉錄因子，屬Fox家族，其屬于控制包括增殖、成熟、死亡在內的整個細胞生命周期的基因家族之一，與腫瘤生長和轉移相關2。研究人員用基因缺失小鼠研究Foxm1b基因和肝癌的關系，結果顯示這個基因的存在對癌細胞增殖至關重要1。本研究試圖通過構建Foxm1b基因原核表達載體，制備多克隆抗體，并用此抗體檢測肝癌細胞中的Foxm1b基因的表達，為深入研究肝癌的分子機制奠定基礎，為研究進一步Foxm1b基因的功能提供條件。 1 材料和方法 1.1 材 料 E.coli DH-5、BL-21(DE3)和人肝癌

9、細胞株SMMC-7721由本室保存；SD大鼠（Sprague Dawley，遠交群大鼠）由中山大學中山醫學院動物中心提供；載體pET-28a(+)購自Novagen公司；T4 DNA連接酶為Promega公司產品；DNA純化回收試劑盒購自賽百勝公司；His Bind Purification kit購自Novagen公司；弗氏佐劑購自Sigma公司；DMEM購自Gibco公司；RNA提取試劑盒購自Fastagen公司。 1.2 方 法 1.2.1 引物設計 在GenBank中獲得人類Foxm1b基因的全長cDNA序列(基因登錄號：BC006529)，用PCgene軟件分析其可能的抗原表位序列，

10、在主要抗原表位序列區的兩側設計一對引物，并在5端引入BamH酶切位點,3端引入Xho酶切位點。上游引物為：5-GAG GGA TCC ATG ACC ATC AAA ACC GAA CTC CC-3；下游引物為：5-GAG CTC GAG CTG GGA GGC AGG GTC AGA G-3。 1.2.2 總RNA的提取和目的片段的擴增 用加有10%胎牛血清的DMEM培養基培養人肝癌細胞SMMC-7721，待細胞長滿后用0.25%胰酶消化，離心收集細胞，用RNA提取試劑盒提取總mRNA并立即逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，用上述PCR引物擴增目的片段，PCR反應條件為：94 預變性5 m

11、in，按94 1 min、63 50S、72 1 min 的條件進行35個循環后72 延伸10 min。 1.2.3 原核表達質粒的構建及鑒定 PCR擴增出的目的片段及pET-28a(+)經BamH和Xho雙酶切后，分別純化回收后T4 DNA連接酶16 水浴連接過夜，轉化到E.coli DH5中，涂布到卡那霉素抗性的LB培養板上，37 培養1216 h，挑選單克隆進行PCR及質粒雙酶切鑒定，挑選2個陽性克隆進行測序，鑒定目的片段的序列及編碼框是否正確。 1.2.4 原核表達和純化 將測序鑒定正確的pET-28a(+)-Foxm1b原核表達質粒轉入E.coli BL-21(DE3)，挑取單克隆接

12、種到含50 ?滋g/mL卡那霉素的LB培養基中，37 250 r/min活化過夜，按1 100的比例接種于新鮮的含50 ?滋g/mL卡那霉素的LB培養基中，37 培養至OD6000.6時，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 誘導5 h。離心收集菌體，每克菌體加3 mL裂解液重懸，超聲波破碎菌體，12 000 × g離心力離心，收集上清，純化表達重組蛋白， 經SDS-PAGE鑒定后用pH 7.4的PBS透析，Bradford法測定蛋白濃度。 1.2.5 Foxm1b多克隆抗體的制備及效價檢測 純化后的Foxm1b蛋白與弗式佐劑等體積混合乳化，腹部皮下多點注射免疫SD大鼠。 首次

13、免疫用完全佐劑，每只大鼠200 ?滋g純化蛋白；之后的免疫用不完全佐劑，每只大鼠每次100 ?滋g純化蛋白。隔周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫2周后心臟采血得血清，用ELISA法測定血清效價，每孔包被有5 ?滋g純化后的蛋白，血清的稀釋度為1 50到1 50 000； 二抗為HRP-兔抗大鼠IgG（稀釋度為1 20 000）。 1.2.6 免疫細胞化學鑒定重組Foxm1b蛋白抗體對天然抗原的識別 人肝癌細胞SMMC-7721傳代并爬片于經多聚賴氨酸處理的防脫玻片上，用4%甲醛-PBS固定細胞15 min，PBS沖洗玻片后用5%BSA-PBS 4 封閉過夜，再用PBS洗3次，加入含多克隆抗體的

14、血清（1200）37 孵育2 h，PBS洗3次后加二抗（HRP-兔抗大鼠IgG，1 2 000）37 孵育1 h，PBS洗4次，顯色試劑盒顯色。 2 結 果 2.1 目的片段的選擇和原核表達質粒構建 用PCgene軟件分析由cDNA推導的人類Foxm1b氨基酸殘基序列，發現三個抗原表位：氨基酸殘基459-464位：Arg-Glu-Arg-Arg-Glu-Arg；361-366：Pro-Gly-Lys-Glu-Glu-Lys；141146：Glu-Met-Glu-Glu-Lys-Glu。所選擇的目的片段包含了前兩個抗原表位，長度為705 bp。 目的片段經PCR擴增后克隆到表達載體pET-28a

15、(+)，經雙酶切鑒定（圖1）和測序鑒定，證實原核表達載體構建成功，序列與GenBank中序列一致。 2.2 Foxm1b蛋白的原核表達和純化結果 測序正確的重組克隆經IPTG誘導表達和His親和純化，得到純度較高的Foxm1b蛋白，測定純化后蛋白濃度為0.3 mg/mL。經SDS-PAGE鑒定（圖2），在約27 ku處出現目的條帶，與理論預測分子量（26.15 ku）相一致。 2.3 抗體的效價和對天然Foxm1b蛋白的識別 Western-bloting結果（圖3）表明純化所得的重組Foxm1b蛋白具有很好的免疫原性。ELISA測定免疫大鼠所得多克隆抗體的效價為1:12 800，且能夠很好的

16、識別人肝癌細胞SMMC-7721中的天然Foxm1b蛋白（圖4）。 3 討 論 Foxm1b基因在組織器官的發育中起著關鍵性作用3,4，也在人類的多種腫瘤中呈現轉錄和表達量的明顯增加，是近年來備受關注的研究熱點5-7。在肝癌組織中同樣出現Foxm1b蛋白的高表達，而且表達量的大小可用于判斷肝癌的分化程度和患者的預后8。最新的資料顯示，以Foxm1b基因為靶標的治療肝癌的實驗研究已經初步開展9。因此，對Foxm1b基因在肝癌發生、發展、診斷和治療中的重要作用值得進一步深入研究。本研究利用生物信息學方法分析Foxm1b基因，發現三個抗原表位，針對其C-端的兩個抗原表位序列（Arg-Glu-Arg-

17、Arg-Glu-Arg； Pro-Gly-Lys-Glu-Glu-Lys）設計引物，采用原核表達系統，成功地表達出目的肽段。針對抗原表位設計引物擴增目的片段而不是擴增Foxm1b全長cDNA是因為：Foxm1b全長cDNA編碼區有2244個bp，過長的序列不利于蛋白表達；針對抗原表位的抗體將具有更好的敏感性和特異性。SDS-PAGE檢測發現在超聲破碎菌體的上清和沉淀中均存在重組蛋白，說明此重組蛋白可以以可溶形式表達，這使得重組蛋白的純化變的相對容易。取上清液進行親和純化，用純化產物免疫大鼠制備的多克隆抗體經ELISA檢測具有較高的抗體滴度，并能很好地識別人肝癌細胞SMMC-7721中的天然Fo

18、xm1b蛋白，表明表達的重組蛋白具有很好的免疫原性和免疫反應性。此多克隆抗體的制得為進一步研究Foxm1b基因在肝癌發生、發展、診斷和治療中的重要作用奠定了基礎。【參考文獻】 張昌卿，肖錫賓，馮凱濤，等. 肝癌組織中P73蛋白表達的意義 J. 中山大學學報：醫學科學版, 2002,23(5s):8-10.曹冬梅, 盧 建. 叉頭框(Fox)轉錄因子家族的結構與功能 J. 生命科學, 2006,18(5):491-496. WANG X, KIYOKAWA H, DENNEWITZ M B, et al. The Forkhead Box m1b transcription factor is

19、essential for hepatocyte DNA replication and mitosis during mouse liver regenerationJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(26):16881-16886. KIM I M, RAMAKRISHNA S, GUSAROVA G A, et al. The forkhead box m1 transcription factor is essential for embryonic development of pulmonary vasculature J. J Biol Chem, 2005, 280(23):22278-22286. KIM I M, ACKERSON T, RAMAKRISHNA S, et al. The Forkhead Box m1 transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer J. Cancer Res, 2006, 66(