1、復合誘變選育高產3-羥基丁酮枯草芽孢桿菌第25卷第3期2021年9月青島大學(工程技術版)JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY(E&T)Vo1.25NO.3Sep.2021文章編號:10069798(2021)03008906復合誘變選育高產3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌尹明浩,徐慧.,程殿林,王勇(1.青島大學生物系,山東青島266071;2.天津科技大學生物工程學院,天津300457)摘要:選育高產3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌,將一株枯草芽孢桿菌YD一1作為出發菌株,通過紫外線,硫酸二乙酯反復誘變處理,選取每一輪發酵3一羥基丁酮產量最高的菌株進入下一輪誘變.結果說明,

2、菌株的復合誘變條件是在照射距離為25cm時紫外誘變30S后再經10%的硫酸二乙酯誘變處理30min,然后進行有利突變株的篩選,通過初篩,復篩和遺傳穩定性試驗,獲得1株遺傳性狀穩定的3一羥基丁酮高產菌,其產量高達19.02g/L,比誘變前提高了5O.95,其遺傳物質經RAPD分析,與出發菌株YD一1相比有較大差異.得到的枯草芽孢桿菌新菌株3一羥基丁酮產量高而殘糖量低.關鍵詞:3一羥基丁酮;枯草芽孢桿菌;復合誘變;RAPD中圖分類號:Q939.97文獻標識碼:A3一羥基丁酮具有特有的奶油香味,除了用作奶油,干酪,咖啡的香味增強劑外,還可作為一種重要的化合物來合成多種稀有藥物和藥物中間體,制造特香型

3、烤煙等.作為一種食用香料,我國GB2760-86已明確規定允許其食用口.目前,3一羥基丁酮的生產方法主要有3種:化學合成法,酶法轉化和微生物生產法.化學合成法和酶法轉化都是以丁二酮或2,3一丁二醇為原料E,區別在于酶法轉化產物得率高,沒有其它副產物,但要獲得大量特異性的酶比擬困難.丁二酮和2,3一丁二醇本身也是合成香料,而非大宗化工產品,原料來源及價格都受到限制,這是當前限制3一羥基丁酮大規模生產的原因之一.與前二者相比,微生物發酵法具有工藝簡單,條件溫和,原料來源廣泛,價格廉價等優點,是3一羥基丁酮最有潛力的生產方法.但目前有關微生物生產3一羥基丁酮的文獻,大多為代謝途徑理論方面的研究,少數

4、涉及3一羥基丁酮生產的報道也主要是作為丁二酮和2,3一丁二醇發酵的副產物提及_3.因此,誘變篩選一株高產3一羥基丁酮的菌株具有極其重要的科研意義和現實意義.本實驗采用紫外一硫酸二乙酯復合誘變的方法,選育出一株高產3一羥基丁酮的枯草芽孢桿菌.1材料與方法1.1材料,主要試劑及儀器1.1.1出發菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)YD一1,本實驗室保存.1.1.2主要培養基1)斜面培養基(g/L):酵母粉5;硫酸錳0.1;蛋白胨10;氯化錳1;瓊脂20;pH7.0.2)種子培養基(g/I):葡萄糖80;硫酸銨1;酵母粉5;玉米漿10;磷酸氫二鉀1;pH7.0.3)發酵培養基(g/L

5、):葡萄糖120;玉米漿10;酵母粉5;硫酸銨l_5;硫酸錳0.05;pH.3試劑收稿日期:20210505作者簡介:尹明浩(1984一),男,碩士研究生,研究方向為微生物工程.通訊作者:程殿林,教授.Email:chengdianlin163.eom90青島大學(工程技術版)第25卷10的硫酸二乙酯(DES):取0.2mL硫酸二乙酯,參加1.8mI無水乙醇,混合均勻;25硫代硫酸鈉:硫代硫酸鈉25g,用水定容至100mL;緩沖液:0.2MNaHPONaHP,pH7.0;隨機引物由上海生物工程公司合成,共2O個引物;TaqDNA聚合酶,dNTPs,RNase購自大連寶生物工程公司

6、;其他常規試劑為國產分析純.1.2實驗方法1.2.1枯草芽孢桿菌發酵工藝取斜面菌種一環,接種于盛有30mL種子培養基的250mL三角瓶中,180r/rain,37搖床培養18h.取2mL培養液轉接入另一只盛有30mL發酵培養基的三角瓶中,37搖床培養3d.1_2.2肌酸甲奈酚法測定3一羥基丁酮-在堿性條件下,3一羥基丁酮可與肌酸和甲萘酚生成粉紅色復合物,該復合物在530nm處有最大吸收峰.取8支干凈比色管分別加人3一羥基丁酮標準溶液和顯色劑,6O顯色反響15min,721分光光度計530nm測吸光值(OD值),以OD值為縱坐標,3一羥基丁酮含量為橫坐標繪制3一羥基丁酮標準曲線,如圖1所示.計算

7、公式為T一00224V××10lV式中,丁為3一羥基丁酮含量,g/L;V為樣品體積,mL;A涮為吸光度;為稀釋倍數.1.2.3復原糖濃度的測定利用DNS法I6測定復原糖含量.1.2.4紫外誘變及菌株篩選將培養6h的菌懸液進行梯度稀釋,調整細胞質量濃度為1x1O個/mL,取1OmL置于9cm培養皿中(內置3一羥基丁酮質量仉g圖13一羥基丁酮標準曲線一滅菌處理的磁力攪拌針),置于紫外誘變箱的磁力攪拌器上,調整照射距離為25cm,翻開皿蓋,分別照射lO,20,3O,4O,5O,6O,7O,8O,90,100s.取不同誘變時間的菌懸液】mL,稀釋到比誘變前少一個稀釋度,取0.1mL

8、誘變液涂布平板,每個稀釋度作三皿平行試驗,在37下培養3d.待菌落長出后,計算每皿菌落數,計算誘變后存活細胞濃度,繪制致死曲線.1.2.5DES誘變將培養至對數生長期的菌懸液梯度稀釋,調整細胞濃度為1×10個/mL,取5mL置于250mL碘量瓶中,參加pH7.0的磷酸緩沖液5mI,10%的DES0.1mL,于37下震蕩培養10,20,30,4O,5O,60min,處理完畢后立即參加1mL25的硫代硫酸鈉溶液終止反響,適當稀釋后涂布平板,37恒溫培養.1.2.6枯草芽孢桿菌基因組DNA的提取7取培養24h的枯草芽孢桿菌菌懸液1mI,10000r/min離心1min,沉淀以500LTE充

9、分懸浮后加入1OL溶菌酶于37水浴保溫30min;加5OL1O的SDS溶液和5L蛋白酶K,充分混勻后置56水浴3h;加等體積的飽和酚,充分混勻,12000r離心10min,抽取上清液加等體積的飽和酚:氯仿(1:1),重復抽提一次;取上清液加1/10體積的3mol/L的醋酸鈉(pH5.2)和1LRnaseA充分混勻,37放置2h;12000r離心10rain,棄上清后,參加500L70的乙醇洗滌兩次;12000轉離心10min,棄上清,置于超凈工作臺中枯燥,沉淀溶于5OLTE中;將提取的各酵母菌株DNA按紫外吸收法檢測0D.和0D.,并計算其濃度.1.2.7RAPD分析以提取各枯草芽孢桿菌菌株D

10、NA為模板,用不同的隨機引物分別進行PCR擴增.25L反響體系中參加1O/zgDNA模板,10×PCRBuffer2.5L,25mmol/LMgL,Taq酶5U,2.5mmol/LdNTPs3I,20/mol/L隨機引物1L,加ddw至總體積25I,于基因擴增儀中進行擴增反響.反響程序:94預變性4min;94變性1rain,36退火1min,72延伸2rain進行35個循環;再72延伸10min.反響一一/一/4.葉葉格第3期尹明浩,等:復合誘變選育高產3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌91結束后,取擴增產物10L于1瓊脂糖凝膠中電泳,EB染色30min后紫外燈下觀察并拍照記錄結果.2結果與

11、討論2.1繪制生長曲線挑取枯草芽孢桿菌菌株YD一1菌落于裝有30mL發酵培養基的250mI三角瓶中,180r/min,37下培養不同時間后,530nm下測定OD值,得到枯草芽孢桿菌生長曲線,如圖2所示.可以看出,新接種的枯草芽孢桿菌YD一1在培養的前2h中生長緩慢,37培養2h后進入對數生長期,持續增長直到培養8h后到達穩定期.2.2紫外誘變參考圖2所得結果,取培養6h的對數生長期枯草芽孢桿菌YD一1菌懸液5mI,按照1.2.4中所述方法進行誘變處理,致死曲線如圖3所示.可以看出,枯草芽孢桿菌菌懸液接受紫外線照射時,致死率變化較為明顯,隨著處理時間的延長,YD一1的致死率呈不斷升高趨勢,在處理

12、時間超過40S后,致死率變化趨向平緩,處理60s后致死率已接近100oA.目前傾向于認為在較低的致死率下,正向突變的幾率更高9.對于紫外誘變,致死率在7585%之間時誘變劑量相對較低,本實驗選擇80的致死率,相應誘變時間為30S.誘變菌株經過兩輪復篩,從中選取高產菌株,將其命名為M一3O并保存,進行下一步誘變.凸0時間t/h圖2枯草芽孢桿菌YD一1生長曲線2.3硫酸二乙酯(DES)誘變2.3.1繪制硫酸二乙酯致死曲線在37搖床中對M一3O用DES處理不同時間后,涂布于瓊脂平板,37恒溫培養2d后,以平板菌落計數法計算活菌數,繪制DES致死曲線如圖4所示.由圖可以看出,隨著處理時間的延長,菌株的

13、死傷程度增加,其細胞存活率明顯下降,經過DES處理2O,3O,40rain后,M一3O的致死率分別為66,85和正交實驗確定DES誘變參數蚪旃旃旃誘變時間,/s圖3紫外誘變致死曲線0圖4DES致死曲線DES誘變的影響因素有誘變溫度,DES濃度和處理時間,以此為條件做3因素3水平正交實驗,結果如表1和表2所示.由表2中極差分析可以看出,對M一30的DES誘變效果影響因素依次為DES濃度>處理時間>誘變溫度.實驗結果還說明,A.B.C組為最正確組合.即DES處理條件最優組合為:DES質量濃度為1l7.7g/L,處理時間為30min,處理溫度為37.表1D

14、ES誘變枯草芽孢桿菌的因素及水平92青島大學(工程技術版)第25卷2.3.3復合誘變正突變菌株的選出將活化后的M一3O按上述條件進行誘變處理,即DES質量濃度為1l7.7g/L,在37下,振蕩處理30min,速加過量硫代硫酸鈉溶液中止反響,吸取誘變后的菌0.1mL涂布于瓊脂平板,37恒溫培養2d挑菌,進行發酵實驗.透過反復篩選,得到3一羥基丁酮產量較高的突變菌株10株,分別命名為s一1s一10,發酵3d后,將搖瓶發酵液補蒸餾水恢復原體積30mL,按照1.2.2所述方法測定其3一羥基丁酮產量,結果如表3所示.表2各因素對DES誘變效果的正交實驗實驗號誘變溫度/lDES質量濃度/(g?L一)123

15、l23123處理時間/3mln123231312羥基丁酮產量/(g?L一)表3各菌株發酵結果分析比擬菌株3一羥基丁酮/(g?L)殘糖/菌株3一羥基丁酮/(g?L-1)殘糖/YD一112.6O0.87S一518.690.70M一3O15.780.88S一617.210.68S一118.450.46S一718.030.59S一117.220.65S一817.660.41S一318.760.66S一918.780.32S一416.960.76S一1019.O20.45由表3可以看出,經過反復篩選所得到的絕大局部菌株,其3一羥基丁酮產量均有不同程度的提高,其中,S一1O的產量在19.00g/L左右,提

16、高幅度較大(如表4所示)且菌株的殘糖量也較低,較之其他枯草芽孢桿菌菌株具有很大的發酵優勢,因此,選取該菌株進行遺傳穩定性實驗.2.4遺傳穩定性實驗將誘變所得突變株S一1O在斜面上連續傳代8次,按照】.2.1中所述方法進行發酵實驗,按1.2.2及1.2.3中所述方法測定3一羥基丁酮和殘糖,結果如表5所示.由表5可以看出,S10遺傳穩定性良好,各代間幾乎無差異,在連續傳代8次之后,發酵產物中3一羥基丁酮含量仍保持在19.00g/L左右,無太大波動,殘糖含量低且穩定,具備作為生產菌株的潛力.2.5RAPD實驗結果表4出發菌株與誘變菌株3一羥基丁酮產量比擬表5S一10遺傳穩定性實驗代數.一.丁量殘糖質

17、量分數/2O個隨機引物的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳發現,只有5個隨機引物擴增產物有條帶出現,實驗重復3次,結果如圖5所示.23456789一I一一R第3期尹明浩,等:復合誘變選育高產3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌93圖5中,每一隨機引物擴增產物左側為出發菌株YD一1,右側為S一1O.每條隨機引物以YD一1和S一10全基因組DNA為模板經PCR擴增產物中第4條隨機引物擴增結果最為顯著,這充分說明經化學誘變所得到的S一10與出發菌株相比遺傳特性發生了一定改變.3結束語物理誘變,化學誘變是誘變微生物,篩選優良菌株的有效手段.硫酸二乙酯和紫外線作用機理不同,但均可誘導微生物細胞中的DNA發生突變,從而影響微生

18、物的原有性狀,使其具有新的特性.筆者采用物理誘變劑紫外線和化學誘4500300020001200800500200圖5RAPD實驗結果變劑硫酸二乙酯對枯草芽孢桿菌YD一1進行復合誘變.照射距離為25cm,紫外誘變30s后的菌懸液用質量濃度10的硫酸二乙酯誘變處理3Omin,通過初篩,復篩獲得了一株3一羥基丁酮高產菌株S一10,產量高達19.02g/L,比誘變前提高了50.95.遺傳穩定性實驗說明該菌遺傳性能穩定,殘糖含量較低,同時利用RAPD技術對出發菌株YD一1及S一10進行遺傳物質分析,發現兩者之間確實存在遺傳物質差異,由此得到一株高產3一羥基丁酮且遺傳穩定性良好的枯草芽孢桿菌新菌株.對其

19、更深入的研究,尚需進一步工作完成.參考文獻:1凌關庭.食品添加劑手冊(2版)M.北京:化學工業出版社,1997.2張小舟,曾崇余,任曉乾.乙偶姻合成研究現狀及展望J.江蘇化工,2001,29(4):2931.3GuptaKG,YadavNK,DhawanS.LaboratoryScaleProductionNofacetoInplusDiacetylbyEnterobacterCloacaeATCC27613J.BiotechnologyandBioengineering,1978,20(12):18951901.4UiS,MasudaH,MurakiH.Laboratory-ScalePnx

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23、n一/in.WANGYong(1.BiologyDepartmentofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China;2?CollegeofBioengineeringTianjinUniversityofScienceandTeehnology,Tianjin300457,China)Abstract:Theaimofthisstudywastobreednewstrainswhichhavehigherproductionofacetoin.WithaBacillussubtilisastheoriginalstrain,andundermutationbyu

24、ltraviolet(UV)anddiethy1suIfate(DES).weusethehighestacetoinproducingStrainofBacillussubtilisineachmutationtreatmenastheorigina1strainnthenextmutation?ThecompoundmutationconditionofYD一1strainwasthatafterthestartingtainwasmutatedbyultravioletfor30satthedistanceof25cm,itwasmutatedby10%diethy1suIfatefor

25、30rain,thentheavailablemutantwasscreenedandaHighacetoin-producingStrainofB口cillsbtiliswithstablegeneticcharacterswasobtainedthroughtheprimaryscreeffing,secondarysereeningandthege-netlestabilityexperiment.Theaeetoinproductionwas19.02g/L,whichwas5O.95higherthanthetartingstrain?Thegeneticsubstancesoftw

26、ostainsweredifferentthroughRAPDanalysis.AnewB口cillussubtiliswithhighacetoinproductionandlowresidualsugarwasobtained.Keywords:acetoin;Bacillussubtilis;compositmutation;RAPD(從第88頁轉來)StudyontheTemperatureFieldstributionfortheConstantVolumeCombustionBombZHAOYulei,ZHANGJipeng,(CollegeofMechanicalandElectronicEngineering,WANGDechang,HUOWeiQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)Abstract:Basedontheconstan