1、第七章第七章 常用分子生物學(xué)技術(shù)常用分子生物學(xué)技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 基因工程基因工程 第二節(jié)第二節(jié) PCR技術(shù)技術(shù)第第 一一 節(jié)節(jié) 基因工程基因工程 Genetic engineering目的目的 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程基因工程(genetic engineering) 利用基利用基因克隆方法獲取目的基因并使克隆的基因表達(dá)因克隆方法獲取目的基因并使克隆的基因表達(dá)為蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物或定向改造細(xì)胞乃至生物為蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物或定向改造細(xì)胞乃至生物個(gè)體的特征及相關(guān)的工作稱基因工程個(gè)體的特征及相

2、關(guān)的工作稱基因工程1、基因工程、基因工程2、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識(shí)別是識(shí)別DNA的特異序列的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H3、基因載體、基因載體為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。常用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA粘粒粘粒DNA

3、克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 多核甘酸激酶等多核甘酸激酶等重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工

4、具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5磷酸基和磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補(bǔ)填補(bǔ)3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無(wú)

5、外切活性，而無(wú)53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基三、重組三、重組DNA技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺

6、傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的人工的DNA）與載體）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能接合成一具有自我復(fù)制能力的力的DNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱分子，也稱基因克隆或基因克隆或 DNA克隆克隆 。 基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和

7、構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 重組重組DNADNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為 分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 表表表達(dá)目的基因表達(dá)目的基因 第二節(jié) PCR概述PCR技術(shù)的創(chuàng)建技術(shù)的創(chuàng)建故事發(fā)生在1983年的春夏之交Kary B. Mullis (1944 -)PCR的發(fā)明人的發(fā)明人PCR: Polymerase Chain ReactionKary B. Mullis（1944）Kary B. Mull

8、is (1944 -)，在在Cetus公司工作期間，公司工作期間，發(fā)明了發(fā)明了PCR。 他原本是他原本是要合成要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，測(cè)序工作， 卻常為沒(méi)有卻常為沒(méi)有足夠多的模板足夠多的模板DNA而煩而煩惱。惱。1983年春夏之交的年春夏之交的一個(gè)晚上，他開(kāi)車去鄉(xiāng)一個(gè)晚上，他開(kāi)車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用下別墅的路上萌發(fā)了用引物引物（而不是一個(gè)（而不是一個(gè)引物）引物）去擴(kuò)增模板去擴(kuò)增模板DNA 的想法的想法.Mullis開(kāi)車的時(shí)候開(kāi)車的時(shí)候, 瞬間感覺(jué)兩排路燈就是瞬間感覺(jué)兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開(kāi)來(lái)的車象是開(kāi)來(lái)的車象是DNA聚合酶，面對(duì)

9、面地合成著聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA， 1983年年9月中旬月中旬 1983年春，年春，Mullis發(fā)展出發(fā)展出PCR的概念；的概念； 1983年年9月，月，Mullis用大腸桿菌用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個(gè)聚合酶做了第一個(gè)PCR實(shí)實(shí)驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)；驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)； 1983年年12月，用同位素標(biāo)記法看到了月，用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的個(gè)循環(huán)后的49 bp長(zhǎng)度長(zhǎng)度的的第一個(gè)第一個(gè)PCR片斷；片斷； 1985年年12月月20日，日，Mullis的同事的同事Saiki在在Science上發(fā)了一篇上發(fā)了一篇論文，方法中用了論文，方法中用了PCR技術(shù)，導(dǎo)致技術(shù)，導(dǎo)致Mullis的文章

10、到處被拒；的文章到處被拒； 1985年年10月月25日申請(qǐng)了日申請(qǐng)了PCR的專利，的專利，1987年年7月月28日批準(zhǔn)日批準(zhǔn)（專利號(hào)（專利號(hào)4,683,202 ），這回），這回Mullis是第一發(fā)明人。是第一發(fā)明人。 1986年年5月，月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開(kāi)在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開(kāi)始學(xué)習(xí)始學(xué)習(xí)PCR的方法；的方法； 1986年年6月，月，Cetus公司純化了第一種高溫菌公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，聚合酶，Taq DNA polymerase，這是，這是85年春天年春天Mullis建議做的；建議做的； 1988年，第一臺(tái)年，第一臺(tái)PCR儀問(wèn)世

11、；儀問(wèn)世； 1991年，年，Hoffman LaRoche以以3億美元的代價(jià)從億美元的代價(jià)從Cetus公司獲公司獲得全權(quán)開(kāi)發(fā)權(quán)。得全權(quán)開(kāi)發(fā)權(quán)。 Mullis的上司有句的上司有句“名言名言”，“我們我們要擴(kuò)增這么多要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用樣品有什么用”； 到了到了1991，Cetus公司以公司以3億美元的億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后公司，并在此后的經(jīng)營(yíng)中又獲得了數(shù)億美元的分紅；的經(jīng)營(yíng)中又獲得了數(shù)億美元的分紅； Mullis于于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，PCRPCR技術(shù)與體內(nèi)技術(shù)與體內(nèi)DN

12、ADNA復(fù)制的區(qū)別：復(fù)制的區(qū)別： 1. PCR 1. PCR不需要解旋酶；體內(nèi)不需要解旋酶；體內(nèi)DNADNA復(fù)制需要；復(fù)制需要； 2. PCR 2. PCR需要耐熱的需要耐熱的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性； 3. PCR 3. PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)內(nèi)DNADNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。 一、一、PCRPCR的定義的定義 在引物指導(dǎo)下由酶催化的在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定克隆或基因組對(duì)特定克隆或基因組

13、DNADNA序列序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。二、二、PCR 原理原理過(guò)過(guò) 程程變性變性引物退火引物退火延伸延伸PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理類似于類似于DNADNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。模板模板DNADNA變性：變性：加熱至加熱至9494左右，雙鏈左右，雙鏈DNADNA解離成單鏈；解離成單鏈；模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性) )：5555左右，引物與模板左右，引物與模板DNADNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：引物的延伸：

14、在在Taq DNATaq DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP為原料，為原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈；一條新的雙鏈；重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)變性變性-退火退火-延伸延伸三過(guò)程，使三過(guò)程，使DNADNA擴(kuò)增量呈指擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。數(shù)上升。 PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性PCR循環(huán)循環(huán)退退火火PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸PCR整個(gè)過(guò)程整個(gè)過(guò)程PCR productPCR product三、PCR的反應(yīng)體系和

15、方法 PCR管加熱使模板變性, 退火使引物與模板DNA互補(bǔ),延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。 緩沖液原料引物模板 DNA聚合酶1）PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/

16、100L。 模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3 PCR反應(yīng)條件 經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）30次 可用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。 逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCR擴(kuò)增6) 熒光定量熒光定量 PCR（real-time PCR) 熒光定量熒光定量 PCR儀儀7）重組PCR 將兩個(gè)不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。 即先分段對(duì)模板擴(kuò)增，除去多余的引物后，將產(chǎn)物混合，再用一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到的產(chǎn)物是一個(gè)重組的DNA.五五 PCR PCR反應(yīng)特點(diǎn)反應(yīng)特點(diǎn)（一）特異性強(qiáng)（一）特異性強(qiáng) 靶序列的特異性決定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。靶序列的特異性決定擴(kuò)

17、增產(chǎn)物的特異性。 在較高的溫度下進(jìn)行，引物結(jié)合的特異性在較高的溫度下進(jìn)行，引物結(jié)合的特異性大大增加。大大增加。（二）靈敏度高（二）靈敏度高 PCR PCR 產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加 從從 100 100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞 在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3 3個(gè)細(xì)菌個(gè)細(xì)菌（三）簡(jiǎn)便、快速（三）簡(jiǎn)便、快速 在在DNADNA擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增儀中進(jìn)行變性變性- -退火退火- -延伸延伸反應(yīng)，一般反應(yīng)，一般1 13 3 小時(shí)完成。小時(shí)完成。（四）對(duì)模板的純度要求低（四）對(duì)模板的純度要求低 可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNADNA或或RNARNA擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增檢測(cè)。 I am really happy to be y