1、Lysozyme Action Lysozyme Action And Application And Application 溶菌酶及其應用溶菌酶及其應用 05生物技術生物技術 江浩江浩 81050423 溶菌酶的誕生溶菌酶的誕生 溶菌酶的分子結構溶菌酶的分子結構 溶菌酶的種類溶菌酶的種類 影響溶菌酶活性的因素影響溶菌酶活性的因素 溶菌酶的作用溶菌酶的作用 溶菌酶的應用溶菌酶的應用 溶菌酶溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）又稱細胞壁質酶（Murami dase）或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶（N-Acetyl muramide Glycanohydralase）。在人和動物的多種組

2、織、分泌液及某些植物、微生物中均發現了溶菌酶的存在。隨著研究的不斷深入，發現不僅有溶解細菌細胞壁的溶菌酶，還有作用于真菌細胞壁的種類，同時對其作用機制也有了更進一步的了解。近幾年，人們根據溶菌酶的溶菌特性，將其應用于醫療、食品防腐、畜牧及生物工程中，具有一定的應用價值。 亞歷山大弗萊明(Alexander Fleming)，1881年8月6日出生于蘇格蘭艾爾郡洛奇菲爾德。他是蘇格蘭農民的后裔，家境貧寒。 因發現了青霉素以及它對多種傳染性疾病的治療作用，榮獲1945年諾貝爾生理學或醫學獎。1922年的一天，正在感冒的英國細菌學家Alexander Fleming發現，把一些鼻粘液加入細菌的培養基

3、后會引起細胞的溶解。而這種存在于鼻粘液中的能殺死細菌的重要物質被認為是一種酶， Fleming命名其為溶菌酶（ Lysozyme ）。 溶菌酶相對分子質量為14.6X103，由129個氨基酸組成的單肽鏈蛋白質，含有4對二硫鍵。 溶菌酶分子近橢圓形，大小為4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的構象比較復雜，螺旋僅占25%，在分子的一些區域有伸展著的片層構象。 在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射線晶體（X-ray crystallography）結構分析法闡明了溶菌酶的三維結構(tertiary structure)。 其三維立體結構主要是由多肽鏈

4、借助于各種次級鍵盤繞成具有特定走向的緊密球狀結構，維持這種結構的作用力主要是氫鍵力、范德華力、疏水作用力和鹽鍵力。 溶菌酶的三溶菌酶的三維立體結構維立體結構 按其作用可分類按其作用可分類 按出處分類按出處分類 1.1.細菌細胞壁溶菌酶細菌細胞壁溶菌酶 作用于-1，4糖苷鍵的細胞壁溶解酶 另一種是作用于肽“尾”和酰胺部分的細胞 壁溶解酶 2.2.真菌細胞壁溶菌酶真菌細胞壁溶菌酶 酵母菌細胞壁溶解酶 霉菌細胞壁溶解酶。 按出處分類按出處分類 1. 1. 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4%3.5%，作為溶菌酶類的典型代表，是目前重點研究的對象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。它

5、由18種129個氨基酸殘基組成，具有4個S-S鍵，分子量為14 000，等電點為11.1，最適溫度為50，最適pH值為67，其化學性質非常穩定，在pH1.211.3范圍內劇烈變化時，結構仍穩定不變。遇熱也很穩定，在pH47、100處理1min不失活，是一種穩定的堿性蛋白質，但在堿性條件下對熱穩定性較差。 其它鳥類如鵪鶉、珍珠雞、火雞等的蛋清中也分離純化出溶菌酶，與雞蛋清溶菌酶活性非常相似，也由129個氨基酸組成，雖排列順序有所不同，但活性部位的氨基酸排列則大體相同。 2. 2. 人及哺乳動物溶菌酶人及哺乳動物溶菌酶 人溶菌酶存在于眼淚、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、腎、淋巴

6、組織中，1ml眼淚中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.10.5mg。人溶菌酶由130個氨基酸殘基組成，有4個S-S鍵，分子量為14 600，其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍。 對于哺乳動物溶菌酶，目前已從牛、豬、貓、兔、猴、馬、羊等動物的乳汁中分離出溶菌酶，其化學性質與人溶菌酶相似，但結構尚不清楚，其溶菌活性也遠低于人溶菌酶約3 000倍。曾林（1999）采用瓊脂平板法測定家兔初乳溶菌酶含量。結果表明：初乳溶菌酶含量為（7.962.01）g/ml，常乳溶菌酶含量(5.011.32)g/ml。人及哺乳動物溶菌酶的作用機制與雞蛋清溶菌酶相同。 3. 3. 植物溶菌酶植物溶菌酶 目前已從木瓜、無花果、

7、蕪菁、大麥等植物中分離出溶菌酶，其分子量較大，約為24 00029 100。植物溶菌酶對溶壁小球菌的溶菌活性不超過雞蛋清溶菌酶的1/3，但對膠體狀甲殼質的分解活性則是雞蛋清溶菌酶的10倍。周澤文（1994）從菜心分離溶菌酶表明，酶比活力達3 414. 6U/mg，純化倍數為197.4。菜心溶菌酶在較寬的溫度和pH植范圍內均有活性，最適溫度為60，最適pH值為5.8。高向陽（1997）研究了蘿卜溶菌酶對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿3種革蘭氏陽性菌和變形菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、多殺巴斯德氏桿菌、雛白痢沙門氏菌、產氣桿菌6種革蘭氏陰性菌及釀酒酵母、總狀毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5種真

8、菌的抑菌效果。同時還研究了蘿卜溶菌酶對白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、番茄青枯病菌、水稻細條病菌、水稻白葉枯病菌及煙草青枯病菌6種植物病原細菌的抑菌效果。試驗證明：蘿卜溶菌酶對上述參試的菌種都有不同程度的抑菌作用。 4. 4. 微生物產生的溶菌酶微生物產生的溶菌酶 目前微生物產生的溶菌酶分為7類：內N-乙酰已糖胺酶，此酶同于雞蛋清溶菌酶，破壞細菌細胞壁肽聚糖中的-1，4糖苷鍵；酰胺酶，切斷細菌細胞壁肽聚糖中NAM與肽“尾”之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵；內肽酶，使肽“尾”及肽“橋”內的肽鍵斷裂；-1，3、-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母細胞的細胞壁；殼多糖酶，與葡聚糖酶共同作用，可分

9、解霉菌和酵母；磷酸甘露糖酶，與葡甘露糖酶共同作用，可分解原生質；脫乙酰殼多糖酶，主要分解毛霉和根霉。 5. 5. 噬菌體產生的溶菌酶噬菌體產生的溶菌酶 該酶是一種特異性的酶，由噬菌體感染、誘導產生，但未被感染的宿主細胞上不存在該酶。 影響溶菌酶活性的因素影響溶菌酶活性的因素 1. 1. 溫度對溶菌酶活性的影響溫度對溶菌酶活性的影響 Weaver等發現在60以上牛乳中的溶菌酶活性下降。Hayase等發現溶菌酶通過二硫鍵聚合，180時聚合和降解同時進行，當200時肽鍵的斷裂和重組發生，聚合和降解變得更為劇烈。Genentech和Genencor兩公司用遺傳工程的方法生產出一種改性T4溶菌酶，此酶中

10、有一個新的二硫鍵，這個鍵通過穩定酶的四級結構而增加了溶菌酶的熱力學穩定性，使其在食品防腐方面更為有效。 Frasco等用紅外光譜研究了溶菌酶的熱變性機理，發現它是和水結構密切相關的。其它外側非極性氨基酸殘基對變性無重要影響，從外側極性氨基酸游離出的水在其始變性過程中起重要作用，水進入內部肽-肽鍵中，使蛋白質膨脹和伸展。研究者們假定變性通過減少蛋白質結晶化、增加整個表面積和可利用的極性水合位促進水變構，這使肽-肽鍵向肽-水鍵轉化，引起進一步的蛋白膨脹和伸展，當水加入體系時，其它水形成分子單層直至達到新加入的水不再影響蛋白電荷的層數為止。 2. pH2. pH對溶菌酶活性的影響對溶菌酶活性的影響

11、溶菌酶在酸性pH下是穩定的，此時100的加熱對溶菌酶僅有很小的活性損失，Matsuoka等報道pH4.5（100、3min）、pH5.29（100，30min）的加熱溶菌酶是穩定的。Beychok等報道溶菌酶在pH5.5最為穩定，Cunningham等，Gorini等均發現溶菌酶在酸性時穩定，在堿性時不穩定的試驗結果。 3. 3. 化學物質對溶菌酶的影響化學物質對溶菌酶的影響 Back等研究表明糖和聚烯烴類能增加溶菌酶的熱穩定牲，Hidaka等發現NaCl對溶菌酶也有抗熱變性作用，同時Kravchenko等發現鹽溶液的存在對溶菌酶的活性是十分必要的， Chang的研究也發現溶菌酶的活性在低鹽濃

12、度時和離子強度密切相關的， 在高鹽濃度時溶菌酶的活性受到抑制， 陽離子的價態愈高則其抑制作用愈強。Yashitake等發現具有-COOH和-SH3OH基的多糖對溶菌酶活性有抑制作用。 4. 4. 加工過程對溶菌酶活性的影響加工過程對溶菌酶活性的影響 Schaich發現溶菌酶和過氧化甲基亞油酸鹽一起培養，導致蛋白質溶解度的下降和增加了溶解部分的分子量，Schaich等后來發現是由于在溶菌酶中產生了游離基，而導致其和過氧化的甲基亞油酸作用，研究表明溶菌酶中游離基濃度隨水活性的上升而下降，其原因可能是因為基團的重構和交換。Funes等繼續進行溶菌酶和過氧化甲基亞油酸的作用研究，發現鐵在一個冷凍干燥的

13、模擬體系中溶菌酶在空氣中和過氧化甲基亞油酸作用，有聚合、生物活性損失和其它化學變化。Kanner等發現溶菌酶和過氧亞油酸的反應生成了二聚和高聚體；多聚是因為隨水活性增加共價鍵交聯度、蛋白質不溶性和酶活性損失增加引起的。 .5 5 絡合作用對溶菌酶活性的影響絡合作用對溶菌酶活性的影響 溶菌酶可和許多物質形成絡合物導致其活性喪失。Fleming等（1924）報道了等量蛋清和蛋黃的混合物其溶菌酶無活性，Hartsell報道脫水整蛋僅保留部分溶菌酶活性，Cunningoham等研究表明蛋黃在pH6.2磷酸鹽緩沖液中使純溶菌酶失活，他們觀察發現蛋黃污染蛋清僅有兩個離子交換色譜峰，而不是無污染的3個峰。P

14、arkinson報道了整蛋的色譜分離時無溶菌酶。研究者認為抑制機理是在溶菌酶和蛋黃化合物間形成靜電相互作用的絡合物所致。N-乙酰葡萄糖胺的（1-4）鍵多聚物是溶菌酶的底物，它們間形成一聚、二聚、三聚、四聚體，是溶菌酶的抑制劑。Imoto分析了SDS和溶菌酶的相互作用，NMR、熒光和UV譜表明在沒有引起酶分子整個構象變化的情況下它們之間形成穩定的絡合物。XRD分析表明SDS結合到活性位上強烈抑制了溶菌酶活性，除此之外其它和溶菌酶形成絡合物的物質有：胸腺泡核、酵母泡核、甲狀腺素、甲狀腺球蛋白、-La、咪唑核吲哚衍生物。陽離子如Co2+、Mg2+、Hg2+、Cu2+等均可抑制溶菌酶的活性（10-31

15、0-2mol/l）。 溶菌酶的作用溶菌酶的作用 .1 1 抗菌消炎抗菌消炎 溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性水解酶，此類粘多糖是細菌細胞壁的主要成分之一，該酶能催化水解細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，細菌內容物逸出而使細胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革蘭氏陽性菌，在分泌型免疫球蛋白A、補體的參與下，還能水解革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等。此外，它還可與各種誘發炎癥的酸性物質結合，使其失活，并能增強抗生素和其它藥物的療效，改善組織基質的粘多糖代謝，從而達到消炎、修復組織的目的。 梁愛華（2001）考察在不同溫度下雞蛋清溶菌酶與-內酰胺類抗

16、生素聯合應用對大腸埃希氏菌的生長及內毒素釋放的影響。結果：在不同的培養溫度下，氨芐西林或頭孢噻肟50 g/ml均可導致細菌溶解，并誘導 Escherichia coli釋放大量的內毒素到培養上清液中，這些培養上清液在體外培養的巨噬細胞上可誘導大量的腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素6（IL-6）產生。而雞蛋清溶菌酶與-內酰胺類抗生素聯合使用能阻止細菌溶解，降低細菌內毒素的釋放，并減少巨噬細胞TNF-和IL-6的產生。 2 2 抗病毒抗病毒 溶菌酶能與帶負電荷的病毒蛋白直接作用，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。該酶也可以預防和治療病毒性肝炎，尤其對輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為

17、顯著。在機體內它還有抗流感病毒的活性，其與膽酸鹽的復合物能強烈抑制流感病毒和腺病毒的生長，并能防止皰疹性病毒感染。 3 3 增強免疫力增強免疫力 溶菌酶作為機體非特異免疫因子之一，參與機體多種免疫反應，在機體正常防御功能和非特異免疫中，具有保持機體生理平衡的重要作用。可改善和增強巨嗜細胞吞噬和消化功能，激活白細胞吞噬功能，并能改善細胞抑制劑所導致的白細胞減少，從而增強機體的抵抗力。 4 4 其它方面的藥理作用其它方面的藥理作用 溶菌酶還具有激活血小板的功能，可以改善組織局部血液循環障礙，分泌膿液，增強局部防衛功能，從而體現其止血、消腫等作用。它還可以作為一種宿主抵抗因子，對組織局部起保護作用。

18、2.5 促進雙歧乳酸桿菌增殖 溶菌酶在嬰兒體內可以直接或間接促進嬰兒腸道細菌雙歧乳酸桿菌的增殖，促進嬰兒消化吸收，可以促進人工喂養嬰兒腸道細菌的正常化；能夠加強血清滅菌蛋白（Properdin），-球蛋白（-globulin）等體內防御因子對感染的抵抗力，特別對早產嬰兒有防御體重減輕、預防消化器官疾病、增進體重等功效。 抗菌機理抗菌機理 細菌的細胞壁由胞壁質組成，胞壁質是由N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine）及N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid）交替組成的多聚物，胞壁酸殘基上可以連接多肽，稱為肽聚糖（Peptidoglycan）。肽聚糖是細菌細胞壁

19、的主要成分，它是由NAM、NAG和肽“尾”（一般是4個氨基酸）組成，NAM與NAG通過-1，4糖苷鍵相連，肽“尾”則是通過-乳酰羧基連接在NAM第的3位碳原子上，肽尾之間通過肽“橋”（肽鍵或少數幾個氨基酸）連接，NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網狀結構，作為細胞壁的骨架，上述結構中的任何化學鍵斷裂，皆能導致細菌細胞壁的損傷。溶菌酶能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖，其水解位點是N-乙酰胞壁酸（NAM）的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的4位碳原子間的-1，4糖苷鍵，結果使細菌細胞壁變得松弛，失去對細胞的保護作用，最后細胞溶解死亡。 溶菌酶的應用溶菌酶的應用 1 1 溶

20、菌酶在醫學上的應用溶菌酶在醫學上的應用 溶菌酶作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，具有多種藥理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效。溶菌酶首先適用于五官科各種炎癥。研究表明它對眼、耳、喉、口腔等的急、慢性炎癥均有一定療效。溶菌酶也可用于扁平疣、傳染性軟疣、尖銳濕疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。另外，人體溶菌酶濃度還可以作為多種疾病的診斷指標。目前日本已生產出醫用溶菌酶，其適應癥為出血、血尿、血痰和鼻炎等。 2 2 溶菌酶在食品工業中的應用溶菌酶在食品工業中的應用 溶菌酶是一種無毒、無副作用的蛋白質，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐劑。現已廣泛應用于水產品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐；日本用15mg/kg溶菌酶用于低度酒的防腐，還可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制腸道中腐敗微生物的生存，同時直接或間接地促進腸道中雙歧桿菌的增殖。溶菌酶殺菌防腐，由于不經過加熱，屬于冷殺菌，因而避免了高溫殺菌對食品風味的破壞作用，尤其對熱敏感的物質更具有重要意義。此外，溶菌酶對人體安全、無毒、無害，且具有一定的保健作用。 3 3 溶菌