1、動力組合動力組合組員：柴鮮鮮、王錦、組員：柴鮮鮮、王錦、 安艷松、蔣玉丹安艷松、蔣玉丹測定方法測定方法n微量凱氏（微量凱氏（KjeldahlKjeldahl）定氮）定氮法法n雙縮脲法（雙縮脲法（BiuretBiuret法）法）nFolinFolin酚試劑法（酚試劑法（LowryLowry法）法）n考馬斯亮蘭法（考馬斯亮蘭法（BradfordBradford法）法）n紫外吸收法紫外吸收法標準曲線標準曲線實驗結果實驗結果n稱量豆芽0.2g和2gn樣液的吸光度分別為0.118、0.253和0.110n分別在標準曲線上查的蛋白質含量為15、50和14n算出樣品中含有的蛋白質分別為5100、19125、

2、535.5 內內 容容 導導 覽覽蛋白質的定義及組成蛋白質的定義及組成氨基酸的概述氨基酸的概述蛋白質的介紹蛋白質的介紹蛋白質的應用蛋白質的應用元素組成：元素組成：n元素組成：元素組成：C C、H H、O O、N N、S S、P P除除此之外還含有微量金屬此之外還含有微量金屬FeFe、CuCu、MnMn、ZnZn、CoCo等，個別的有非金屬。等，個別的有非金屬。n蛋白質元素組成的特點蛋白質元素組成的特點 蛋白質的含氮量平均為蛋白質的含氮量平均為16。蛋白質含量。蛋白質含量氮含量氮含量6.25凱氏定氮法測定蛋白質含量的凱氏定氮法測定蛋白質含量的理論依據理論依據蛋白質結構的基本單位蛋白質結構的基本單

3、位氨氨基酸基酸n化學結構屬化學結構屬L-L-型型氨基氨基酸（甘氨酸酸（甘氨酸除外）除外）n氨基酸的結氨基酸的結構通式構通式2.氨基酸的分類分類依據分類依據分分 類類R R基結構基結構脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、雜環族氨脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、雜環族氨基酸基酸R R基酸堿性基酸堿性酸性氨基酸、堿性氨基酸、中性氨基酸酸性氨基酸、堿性氨基酸、中性氨基酸人體內能否自己合成人體內能否自己合成必需氨基酸、非必需氨基酸必需氨基酸、非必需氨基酸分解產物進一步轉化分解產物進一步轉化生糖氨基酸、生酮氨基酸、生糖兼生酮氨生糖氨基酸、生酮氨基酸、生糖兼生酮氨基酸基酸是否用于合成蛋白質是否用于合成蛋白質標準氨基酸、

4、非標準氨基酸標準氨基酸、非標準氨基酸有無遺傳密碼有無遺傳密碼編碼氨基酸、非編碼氨基酸編碼氨基酸、非編碼氨基酸1.1.非極性疏水非極性疏水R R基氨基基氨基酸酸2.2.極性不帶電荷氨基極性不帶電荷氨基酸酸3.3.帶正電荷帶正電荷R R基氨基酸基氨基酸4.4.帶負電荷帶負電荷R R基氨基酸基氨基酸氨基酸可根據氨基酸可根據R R基結構和理化性質進行分類基結構和理化性質進行分類1. 非極性疏水非極性疏水R基氨基酸基氨基酸(一一)1. 非極性疏水非極性疏水R基氨基酸基氨基酸(二二)( (甲硫氨酸甲硫氨酸) )2. 極性不帶電荷極性不帶電荷R基氨基酸基氨基酸Tyr3. 帶正電荷帶正電荷R基氨基酸基氨基酸(

5、堿性氨基酸堿性氨基酸)Page 144. 帶負電荷帶負電荷R基氨基酸基氨基酸(酸性氨基酸酸性氨基酸)(zwitterion)pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性離子氨基酸的兼性離子 陽離子陽離子陰離子陰離子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+三、氨基酸的理化性質三、氨基酸的理化性質1 1、兩性解離、兩性解離pH pI正電荷正電荷 兩性離子兩性離子 負電荷負電荷負極移動（電場中）負極移動（電場中） 不移動不移動 正極移動正極移動

6、n等電點（isoelectric point, pI）：在某一pH環境中，氨基酸解離成陽性離子及陰性離子的趨勢相等，所帶凈電荷為零，在電場中不泳動。此時，氨基酸所處環境的pH值稱為該氨基酸的等電點。紫外吸收：紫外吸收：nTrp、Tyr和和Phe在在280nm波波長附近具有最大長附近具有最大吸收峰，其中吸收峰，其中Trp的最大吸收的最大吸收最接近最接近280nm3、顯色反應：、顯色反應：（1）茚三酮反應）茚三酮反應氨基酸與茚三酮水合物共熱，生成藍紫色化合物，其最氨基酸與茚三酮水合物共熱，生成藍紫色化合物，其最大吸收峰為大吸收峰為4 470nm70nm，可用于氨基酸定量分析。，可用于氨基酸定量分析

7、。 用過量的中性甲醛與氨基酸反應，可游離出氫離子，用過量的中性甲醛與氨基酸反應，可游離出氫離子，然后用然后用NaOHNaOH滴定，從消耗的堿量可以計算出氨基酸的滴定，從消耗的堿量可以計算出氨基酸的含量。此法稱為間接滴定法。含量。此法稱為間接滴定法。(2) (2) 與甲醛的反應與甲醛的反應Sanger 反應 2.42.4一二硝基氟苯（一二硝基氟苯（DNFBDNFB）DNP-DNP-氨基酸，黃色，層析法鑒定，氨基酸，黃色，層析法鑒定， 被被SangerSanger用來測定多肽的用來測定多肽的NHNH2 2末端氨基酸末端氨基酸 Edman反應異硫氰酸苯酯，異硫氰酸苯酯，PITC PITC 苯乙內酰硫

8、脲衍生物苯乙內酰硫脲衍生物（PTH-PTH-氨基酸），無氨基酸），無色，可以用層析法分色，可以用層析法分離鑒定。離鑒定。被被EdmanEdman用來鑒定多用來鑒定多肽的肽的NHNH2 2末端氨基酸末端氨基酸 蛋白質的分子結構包括蛋白質的分子結構包括一級結構一級結構(primary structure)二級結構二級結構(secondary structure)三級結構三級結構(tertiary structure)四級結構四級結構(quaternary structure)高級高級結構結構一、一級結構一、一級結構1 1、定義：、定義：蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順

9、序( (含二硫鍵含二硫鍵) )。基本概念基本概念* 肽鍵肽鍵(peptide bond)(peptide bond)是由一個氨基是由一個氨基酸的酸的 - -羧基與另一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的 - -氨氨基脫水縮合而形成的化學鍵。基脫水縮合而形成的化學鍵。肽與肽鍵肽與肽鍵NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽鍵NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO生物活性肽生物活性肽：n谷胱甘肽谷胱甘肽n神經肽：腦啡肽、內神經肽：腦啡肽、內啡肽、強

10、啡肽、啡肽、強啡肽、P物質、物質、Y肽肽n肽類激素：催產素、肽類激素：催產素、加壓素等加壓素等n其他：生長因子；短其他：生長因子；短桿菌桿菌S；甜味肽等；甜味肽等 維持蛋白質分子構象的化學鍵維持蛋白質分子構象的化學鍵二、二級結構二、二級結構2 2、二級結構存在的形式與特點、二級結構存在的形式與特點 多肽主鏈按右手或左多肽主鏈按右手或左手方向盤繞，形成右手螺手方向盤繞，形成右手螺旋或左手螺旋，蛋白質中旋或左手螺旋，蛋白質中的的-螺旋幾乎都是右手，螺旋幾乎都是右手，右手螺旋比左手螺旋穩定。右手螺旋比左手螺旋穩定。 相鄰的螺圈之間形成相鄰的螺圈之間形成鏈內氫鍵。鏈內氫鍵。（1 1） -螺旋螺旋 典型

11、的典型的-螺旋有如下螺旋有如下特征：特征：每圈螺旋：每圈螺旋：3.63.6個個a.aa.a殘殘基；高度：基；高度：0.54nm 0.54nm 每個殘基繞軸旋轉每個殘基繞軸旋轉100100, ,沿軸上升沿軸上升0.15nm0.15nm。氨基酸殘基側鏈向外。氨基酸殘基側鏈向外。相鄰螺圈之間形成鏈內相鄰螺圈之間形成鏈內氫鏈，氫鍵的取向幾乎氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。與中心軸平行。肽鍵上肽鍵上C=OC=O氧與它后面氧與它后面（C C端）第四個殘基上的端）第四個殘基上的N-HN-H氫間形成氫鍵。氫間形成氫鍵。（2）-折疊折疊 兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈（或同一肽鏈的不同肽段）側向聚集在一兩條或

12、多條幾乎完全伸展的多肽鏈（或同一肽鏈的不同肽段）側向聚集在一起，相鄰肽鏈主鏈上的起，相鄰肽鏈主鏈上的NHNH和和C=0C=0之間形成氫鏈，這樣的多肽構象就是之間形成氫鏈，這樣的多肽構象就是-折疊片。折疊片。氫鍵氫鍵:與與肽 鏈 的肽 鏈 的長 軸 接長 軸 接近垂直近垂直。多肽主鏈多肽主鏈:呈鋸齒狀折疊構呈鋸齒狀折疊構象象側鏈側鏈R基交替地分布基交替地分布在片層平面的兩側在片層平面的兩側反平行式：反平行式：肽鏈的極性肽鏈的極性一順一倒，一順一倒，N端間隔相端間隔相同同. 反平反平-折疊比平行折疊比平行的更穩定的更穩定 - -轉角轉角一般由四個氨基酸組成，一般由四個氨基酸組成，常見氨基酸：常見氨

13、基酸：Pro,Gly以主鏈間氫鍵維持穩定。以主鏈間氫鍵維持穩定。多肽鏈中多肽鏈中180180度回折處度回折處形成的特定構象。形成的特定構象。沒有確定規律性的肽鏈結構，存在于球狀蛋沒有確定規律性的肽鏈結構，存在于球狀蛋白質中。（常常是酶的功能部位）白質中。（常常是酶的功能部位） 三、三級結構三、三級結構 1、定義：整個多肽定義：整個多肽鏈在二級結構、超鏈在二級結構、超二級結構和結構域二級結構和結構域的基礎上盤旋、折的基礎上盤旋、折疊，形成的特定的疊，形成的特定的整個空間結構。整個空間結構。（四）、蛋白質的四級結構（四）、蛋白質的四級結構n亞基亞基(subunit)：寡聚蛋白中的單條獨立的多肽鏈，

14、具有：寡聚蛋白中的單條獨立的多肽鏈，具有獨立的一、二、三級結構，單獨存在時一般無生物學活性。獨立的一、二、三級結構，單獨存在時一般無生物學活性。亞基之間以非共價鍵聯系，亞基可以相同或不同。亞基之間以非共價鍵聯系，亞基可以相同或不同。n亞基之間以非共價鍵聯系，包括疏水鍵（主要）、鹽鍵、亞基之間以非共價鍵聯系，包括疏水鍵（主要）、鹽鍵、氫鍵、范德華力氫鍵、范德華力n亞基可以相同或不同亞基可以相同或不同蛋白質分子中的結構層次蛋白質分子中的結構層次一級結構一級結構二級結構二級結構超二級結構超二級結構結構域結構域三級結構三級結構亞基亞基 四級結構四級結構蛋白質一級結構是空間結構和生蛋白質一級結構是空間結

15、構和生物功能的基礎，一級結構決定空物功能的基礎，一級結構決定空間結構；但一級結構并非決定空間結構；但一級結構并非決定空間結構的唯一因素。空間結構是間結構的唯一因素。空間結構是生物活性的直接體現。生物活性的直接體現。1 1、蛋白質的兩性電離蛋白質的兩性電離 理化性質理化性質 蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pHpH條條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 * 蛋白質的等電點蛋白質的等電點( isoelectric point, pI) 當

16、蛋白質溶液處于某一當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的荷為零，此時溶液的pH稱為稱為蛋白質的等電點。蛋白質的等電點。2 2、蛋白質的紫外吸收、蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收波長處有特征性吸收峰。蛋白質的峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。此可作蛋白質定量測定。 3.蛋白質的膠體性質蛋白質的膠體性質 蛋白質分

17、子直徑在蛋白質分子直徑在1-100nm1-100nm之間，在水溶之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運動，丁達耳現液中具有膠體溶液的通性（布朗運動，丁達耳現象，不能通過半透膜，吸附能力等）。象，不能通過半透膜，吸附能力等）。 穩定蛋白質膠體溶液的主要因素：穩定蛋白質膠體溶液的主要因素： 1 1、蛋白質表面極性基團形成的水化膜。、蛋白質表面極性基團形成的水化膜。 2 2、非等電狀態時，同種電荷的互相排斥。、非等電狀態時，同種電荷的互相排斥。 3 3、質點大小在、質點大小在1-100nm1-100nm，可以進行布郎運動，可以進行布郎運動 4 4、蛋白質的沉淀反應、蛋白質的沉淀反應 1 1、 鹽

18、析：當離子強度增加到足夠高、達到飽和或半飽和程度時蛋白質從鹽析：當離子強度增加到足夠高、達到飽和或半飽和程度時蛋白質從溶液中沉淀出來的現象。溶液中沉淀出來的現象。 2 2、有機溶劑沉淀法、有機溶劑沉淀法 水化膜，降低介電常數，如水化膜，降低介電常數，如PEGPEG、丙酮、乙醇丙酮、乙醇 3 3、重金屬鹽沉淀、重金屬鹽沉淀 pHpHpIpI時帶負電荷，與重金屬離子時帶負電荷，與重金屬離子HgHg2+2+. Pb. Pb2+2+. Cu. Cu2+2+等等 結成不溶性沉淀。結成不溶性沉淀。 4 4、有機酸沉淀法、有機酸沉淀法 pHpH小于等電點時，蛋白質帶正電荷，易有機酸的負離子生小于等電點時，蛋

19、白質帶正電荷，易有機酸的負離子生 成不溶性沉淀。如單寧酸、苦味酸、鎢酸、三氯乙酸、磺基水楊酸成不溶性沉淀。如單寧酸、苦味酸、鎢酸、三氯乙酸、磺基水楊酸 5.蛋白質的變形 概念：概念：在某些理化因素作用下，蛋白質的空間構象在某些理化因素作用下，蛋白質的空間構象破壞，導致若干理化性質和生物學性質的改變。破壞，導致若干理化性質和生物學性質的改變。 變性因素：變性因素：1 1）物理因素：高溫、高壓、射線等）物理因素：高溫、高壓、射線等2 2）化學因素：強酸、強堿、重金屬鹽等）化學因素：強酸、強堿、重金屬鹽等 變性后的表現：變性后的表現：1 1）生物學活性消失）生物學活性消失2 2）理化性質改變）理化性質改變 6.6.蛋白質的顏色反應蛋白質的顏色反應 1 1、雙縮脲反應、雙縮脲反應 雙縮脲：雙縮脲： O OO O H2NC