1、1會計學zhou目的蛋白質表達純化檢測目的蛋白質表達純化檢測實驗原理實驗原理實驗原理圖圖 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋白融合蛋白在在Hela細胞中的熒光顯微鏡檢測（細胞中的熒光顯微鏡檢測（400）例例 酵母表達系統酵母表達系統 昆蟲表達系統昆蟲表達系統 哺乳動物細胞表達系統哺乳動物細胞表達系統 表達的蛋白具有正常的表達的蛋白具有正常的活性、構象活性、構象 技術難度較大、耗時、技術難度較大、耗時、耗資耗資 大腸桿菌表達系統大腸桿菌表達系統 實驗技術簡單，時間實驗技術簡單，時間較短，費用低，系統較短，費用低，系統比較完備比較完備 不能有效地對重組蛋

2、不能有效地對重組蛋白質進行修飾加工，白質進行修飾加工，易形成包涵體易形成包涵體原核細胞表達系統原核細胞表達系統 真核細胞表達系統真核細胞表達系統實驗原理實驗原理PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位點多克隆位點實驗原理實驗原理實驗原理啟動子、終止子、核糖體識別序列操縱子序列及配套的調控基因 誘導性表達所需要的元件多克隆位點復制起始序列實驗原理實驗原理實驗原理實驗原理實驗原理AmpRPlasmidpGEX-KGGSTlacIqPtac PromoterAmprIPTG多克隆位點多克隆位點實驗原理BamH INde IBamH IcDNA酶切酶切Nde I基因片段基因片段酶

3、切后的目的基因酶切后的目的基因 酶切酶切 連接連接轉化轉化篩選（藍白斑）篩選（藍白斑）鑒定（鑒定（PCR、酶切、測序、酶切、測序）原核表達質粒的構建成功原核表達質粒的構建成功實驗原理實驗原理實驗原理實驗原理蛋白質中加入蛋白質中加入 SDS 并加熱，并加熱， SDS 分子上的非極性區分子上的非極性區 (黃色尾巴黃色尾巴)會與蛋白質上的非會與蛋白質上的非極性區結合，使蛋白質變性，成為一線狀長條分子，上面布滿極性區結合，使蛋白質變性，成為一線狀長條分子，上面布滿 SDS 分子。分子。SDS 分分子的極性區子的極性區 (洋紅色圓點洋紅色圓點)，則露在外面，以增加親水性。，則露在外面，以增加親水性。SD

4、S是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質分是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質分子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白質分子間的天然的電荷差異。蛋白質分子間的天然的電荷差異。SDS最終使蛋白質變成具有高負電荷的線狀分子最終使蛋白質變成具有高負電荷的線狀分子。97.0 kDa儀器與設備實驗試劑實驗步驟目的蛋白質的誘導表達及檢測SDS-PAGE12分離膠5%濃縮膠H2O2.45 ml 2.05ml30%丙稀酰胺3.0 ml0.5mlTris 緩沖液1.9 ml（1.5M pH8.8）375ul （1.0M pH6.8）10%SDS75 ul30ul10%過硫酸銨75 ul30ul TEMED3 ul3ul注：1 . 丙稀酰胺為神經毒劑，使用時要小心，操作請務必戴手套。 2. 過硫酸銨需新鮮配制，并注意濃度，否則影響膠凝固。 3. 1塊膠可以用10 ml離心管，2塊膠要使用小三角瓶便于混勻，配制 后余液可暫時留存，便于參考膠凝固時間，一般30min即可。目的蛋白質的檢測-考馬斯亮藍染色凝膠染色End實