1、酵母菌分批發酵試驗一、實驗目的1. 學習酵母菌的發酵方法及其發酵過程的優化控制技術；2. 學習和掌握分批發酵一般過程和操作規程。二、實驗原理釀酒酵母是一種食品級的微生物，人類從幾千年前就開始利用它了，像夏禹 吋期就有儀狄作酒的記載。干酵母蛋白質含量高達45%,冃其蛋片氨基酸品種齊 全，維生素豐富，營養價值較高，是飼料工業、醫的工業、發酵工業和食品工業 的重要原料。早在1900年時，面包酵母已經形成大生產的規模。作為人類食物 的酵母生產，則是在第一次世界大戰時在德國發展起來的。酵母單細胞蛋白一直 是歐美市場上缺乏的蛋門質資源，國內也很匱乏。本實驗在發酵工程課堂教學理論基礎上，以分批發酵法制備釀酒

2、酵母細胞為 實踐內容，深入理解發酵原理、方法以及過程及其優化控制方法。通過實踐與理 論的結合，加深對發酵工程的認識，進一步增進專業能力和素養。發酵工程實驗日程表序號實驗項目時間實驗內容安排1、固體培養基配制500ml/組，分裝2瓶；培養基制預計4學2、培養川1清洗及包扎15副/組；無菌水100ml/瓶；1備與滅菌吸管包扎4支/組；時3、4、液體培養基制備:800ml/組,分裝16瓶，滅菌0. impa, 20min.1、菌種的分離純化:超凈工作臺消毒（uv照射20min） -75%乙醇擦拭臺面；活性酵母菌粉一無菌水溶解（稀釋10"倍）一渦旋震蕩5min；倒平板（10副平酵母菌種預計皿

3、/組）一平板劃線分離一30°c倒置培養。2活化與種2學子制時2、接種準備t作：超凈t作臺消璉（uv照射20min） -75%乙醇擦拭臺而。1、種子培養接種：平板單一菌落一種子培養基（2環/瓶）一渦旋震蕩2、3-5min；搖瓶培養：搖床設置及調節（30°c, 200r/m）-搖瓶固定一啟動培養。發酵罐結 構、操作規1、發酵培養基配制：18l。程及酵母2、發酵讎操作培訓：發酵讎初始狀態檢查及調節一清洗（清水沖洗2-3菌分批發遍）一發酵罐運行啟動一發酵罐運行參數設置一空罐滅菌酵預計（0. 15mpa, 20min）-進料-實罐滅菌（0. 1 mpa 維持 30min）冷卻火焰封口

4、接種一發酵參數穩定狀態調節與維持。38學時3、發酵取樣：取樣管滅菌一取樣再滅菌；4、發酵中間過程分析（0 hour） : ph測定（ph計or精密試紙）；酸度（中和法）；殘糖測定（折光法）；菌體濃度測定（a迦光密度法）5、中間取樣：每間隔4h,取樣管滅菌一取樣一再滅菌.共計4-6次；酵母菌的 形態觀察；預計1、水浸片制作及觀察4酵母細胞6學2、酵母菌分離條件試驗的分離提時取3、發酵結束工作：器川l、設備還原，壞境清潔實驗一培養基制備與滅菌1、實驗原理培養基是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的按一定比 例配制的多種營養物質的混合物。一個完整的培養基配方組成包括組成成分、各 組成成分

5、的濃度和合適的ph。培養基的組成成分主耍冇碳源、氮源、無機鹽和 微量元素、水、生長因了以及特殊用途的前體和誘導物。實驗利用葡萄糖、蛋白 月東、酵母抽提物組成的培養基分批發酵培養酵母菌。滅菌是指從培養基中殺滅有生活能力的細菌營養體及其他了，或從中將其除 去。絕大多數工業發酵是需氧的純種發酵，因此所使用的培養基須徹底滅菌。本 實驗采用121°c, 30min的濕熱滅菌法來對培養基進行滅菌處理。2、儀器、材料和試劑(1) 儀器電了天平；高壓滅菌鍋(2) 材料蛋白瓶 酵母抽提物；葡萄糖；去離子水；ph試紙；naoh； hc1； looml三 角瓶；250ml三角瓶；瓶塞；玻璃棒；稱量紙；lo

6、oml量筒；500ml燒杯；培 養血(3) 試劑固體平板培養基：葡萄糖2%,蛋白腺2%,酵母抽提物1%,瓊脂2%。液體培養基：葡萄糖2%,蛋白膿2%,酵母抽提物1%3、實驗步驟(1) 計算 按固體培養基和液體培養基的配方，計算500汕固體培養基和 800ml液體培養基各物質的用量。(2) 稱藥品 用祛碼天平準確稱量各物質。(3) 溶解 將培養基的組分放加在500ml燒杯的水中，玻璃棒攪拌溶解。 (固體培養基瓊脂在室溫下不能溶解，需加熱煮化)。(4) 分裝 液體培養基每組按50l培養基/250ml三角瓶規格分裝16瓶； 固體培養基分裝250汕培養基/250ml三角瓶。(5) 包扎 三角瓶口塞上瓶

7、塞后用牛皮紙和線繩包扎，以防滅菌吋冷凝水沾 濕棉塞。在紙上寫上培養基名稱、組別、日期。(6) 滅菌 放置于高壓蒸汽滅菌鍋內，121°c濕熱滅菌30mino(7) 倒平板 待高壓蒸汽滅菌鍋降溫至60°c時，取岀培養基，液體培養基 室溫放置，固體培養基在已紫外滅菌的超凈工作臺里倒制5-10只平板。【實驗注意事項】(1) 準確稱量各物質，稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋。(2) 調ph值時要小心操作，避免回調。(3) 不同培養基各有配制特點，要注意具體操作。(4) 滅菌操作中務必待壓力下降到零后，才可打開鍋蓋。實驗二酵母菌種活化與種子制備1、實驗原理菌種活化是指將保存在砂土管、冷凍干燥管、

8、冷凍斜而屮處于休眠狀態的生 產菌種接入試管斜面或平板培養基進行復蘇處理。活化后，再經過扁瓶或搖瓶及 種子罐逐級放人培養而獲得一定數量和質量的純種。這些純種培養物稱為發酵的 種了。 種了的一般制備過程可用下圖表示：a «i沖子礦大堵為詼瓏円1 -砂土鬼子；9 一拎旅于蚩氷子：3 料血他予"民敲體用勲“熨體怎& 一 88*址養抵覽界；匚5片予jus薦；?i»ar22、儀器、材料和試劑(1) 儀器恒溫培養箱；超凈工作臺；恒溫搖床(2) 材料釀酒酵母菌種；接種環(3) 試劑固體培養基；液體培養基3、實驗步驟(1) 超凈工作臺滅菌 打開紫外燈，照射30min,完畢后

9、打開風機吹5mino(2) 準備工作 將酵母菌種和培養基平板放在超凈工作臺中，點燃酒精燈， 用75%的灑精棉球擦拭雙手。(3) 灼燒接種環 將接種環在酒精燈外焰上來回移動著灼燒，其屮螺旋接頭 部分多燒一會兒，接種環燒至紅熱狀態后，移離火焰冷卻。(4) 劃線法分離接種環挑取少量酵母菌，左手拿培養基平板在酒精燈火焰 旁打開，接種環在平板表面分三次作“之”字形劃線。每次劃線后要燒接種環， 再從上一次劃痕的尾部拉出后劃下一區，依次劃成4個區。(5) 菌落培養 將劃線接種的平板倒置于30°c培養箱中培養24h。觀察菌落 的大小、顏色、形狀。(6) 單菌落接種 在超凈工作臺中(注意無菌操作)，將

10、50ml培養基/250ml 三角瓶的瓶口連同瓶塞在酒精燈火焰上旋轉灼燒片刻后取下棉塞，用灼燒過 的接種環挑取一個酵母單菌落，伸入液體培養基中振蕩兒下，取出在火焰上 灼燒，再將瓶塞塞好。再依次完成另外三瓶50ml培養基/250ml三角瓶的接 種操作。(7) 標記 在接種的三解瓶壁上貼上標簽，注明菌種名稱、操作人、日期。(8) 種子培養 將接種后的培養基置于30°c搖床中，200rpm,振蕩培養約 12h。【實驗注意事項】(1) 整個實驗過程要嚴格無菌操作。(2) 標記時請寫明操作者的姓名，方便查找和整理，提高效率。(3) 劃線及接種完后要將接種環在火焰上灼燒，以殺死殘留的酵母菌。實驗三

11、發酵罐結構及使用操作規程1、實驗目的熟悉發酵罐基本結構，了解發酵罐工作原理，學會發酵罐使用方法。2、實驗內容（1）發f罐基本結構組成:1）罐體系統：罐體、夾套、攪拌器、扌半板、進料口、接種口、放料口、 排氣管、進氣管、取樣管、照明燈等。2）滅菌系統：蒸汽發生器、蒸汽分配管、夾套加熱裝置、放料口滅菌裝置、 通氣管取樣管滅菌裝置、空氣過濾系統滅菌裝置。3）溫度控制系統：罐內溫度傳感器（電極）、水箱溫度傳感器（電極）、 恒溫水箱、恒溫水循環管路。4）無菌空氣制備系統：空氣壓縮機、氣液分離器、氣休流量計、氣流調節 器、空氣過濾器（2級）。5）控制系統：電源開關、操作顯示屏、控制器觸摸開關、參數設置轉換

12、調 節屏。標&包叫1dx x.t?rs"百向窮堀錢/電歩窮堀找/電歩發酵罐外形圖+0 2»it kt<1譽代<1譽代0 s十nunxxffmar-油埠jailmis4744約口口淖污口淖污口iul迪用丸發聲經各部兮骨適示意因（2）發酵罐操作規程1）發酵罐工藝操作條件溫度：2540°c。壓力：00. 3mpa（表壓）。滅菌條件;溫度100140°c, 壓力 00. 3mpa （表壓）.ph： 211。需氧量：0. 050. 3 kmol/m3 ho 通 氣量:0.32 v/v/mo功率消耗：0.54kw/m發酵熱量：5, 00020,

13、000 kcal / m3- ho2）清洗工作清洗前應取出ph、do電極。清洗罐內可配合進水、進氣、電機攪拌、加溫 一起進行。清洗后安裝要注意罐內密封圈、硅膠墊就位情況。注意罐與罐座 間隙均衡。3）試車將電極、電機、電纜、進出氣軟管、冷凝器進出水接頭安裝就位；安裝 完畢后要對罐體內通氣（0. 2mpa）作密封性試驗。方法如下：關閉閥門；旋 緊罐體上毎一個接口、堵頭、電極緊固帽；打開空壓機，調節氣閥，使罐壓 保持0. 2mpa左右；對系統進行23小時試運行，如冇問題作相應處理后， 方可正式使用。4）發酵罐使用操作規程如果短期內需再次培養發酵，應對其進行2-3次清水清洗待用。如準備 長期停用，則應

14、對其進行滅菌，然后放去水箱與罐內存水，放松罐蓋緊同螺 絲，取出電極保養儲存好，將罐、齊管道余水放凈，關閉所有閥門，電源， 蓋上防塵罩。發酵罐操作開始前，先關閉所有出料口、取樣口、進氣口，打 開出氣閥；加入發酵培養基，裝注完成后旋緊進料口螺蓋。滅菌：啟動蒸汽發生器，待氣壓達到0. 2mpa以上吋: a開啟發酵罐出氣閥，開啟高壓蒸汽閥將高壓蒸汽通過進氣閥引入夾套，打開夾套排水閥，排一一除蒸汽 冷凝水，控制閥門開量，保持微弱出汽；b. 同吋通過蒸汽分配管將蒸汽引入空氣過濾系統（注意：蒸汽引入前關閉通 向電器控制柜的空氣閥門），使蒸汽通過一級和二級空氣過濾器并順利進入取樣 口出口，保持取樣放出口微弱出

15、汽；c. 另一路蒸汽通過蒸汽閥發酵罐放料口，并保持放料口微弱岀汽；d. 等到罐內培養基溫度達到80°c時，開啟與罐直接相連的通氣閥，將高壓 蒸汽直接接入罐內加熱培養基，并對與罐相連的管道滅菌。e. 直到罐內培養基開始沸騰后，關閉排氣閥，使罐內升壓至0. impa （或滅 菌溫度121°c）,維持溫度0. 5-1. 0小時。關閉蒸汽進氣閥，開啟冷卻水管路系統，通過夾套冷卻發酵培養基，當罐內 壓力接近常壓前向罐內通入無菌空氣，保持罐內空氣壓力0. 03mpa ±下，至 發酵溫度關閉冷卻水系統。啟動空氣壓縮機，開啟進氣閥、使壓縮空氣通過旋風分離器及空氣過濾器， 從進氣閥

16、進入發酵罐，使溶解氧濃度達到發酵初始水平。接種：接種方法可采用火焰接種法或茅壓接種法。比火焰接種法：在接種口用酒精火圈消毒，然后打開接種口蓋，迅速將接種 液倒入罐內，在把蓋擰緊。b.差壓法：在滅菌前放入墊片，接種時把接種口蓋打開，先倒入一定量的酒 精消毒。待片刻后把種液瓶的針頭插入接種口的梨片。利用罐內壓力和種液瓶內 的壓力差，將種液引入罐內，擰緊蓋子。發酵狀態調節乩罐壓：發酵過程屮須手動控制罐壓，即用出口閥控制罐內壓力。調節空氣 流量的，須同時調節出口閥，應保持罐內壓力恒定大于0. 03mpaob溶解氧（do）的測量和控制溶解氧的標定：在接種前，在恒定的發酵溫度卜，將轉速及空氣量開到最 人值

17、時的溶解氧do值作為100%。發酵過程的溶解氧do測量和控制：do的控制可采用調節空氣流量和調節 轉速來達到。最簡單是轉速和溶氧的關聯控制。其次則必須同時調節進氣量（手 動）控制。有時需要通入純氧（如在某些基因工程菌的高密度培養中）才能達到 要求的d0值。c.ph的測量與控制ph值的校正：在滅菌前應對ph電極進行ph值的校正。在發酵過程屮ph值的控制使用嫦動泵的加酸加堿來達到的，酸瓶或堿瓶須 先在滅菌鍋中滅菌。旋松進料口螺旋蓋，在進料口環槽中加入適量酒精棉，點燃 酒精，打開進料口螺旋蓋，將種子三角瓶菌液接入發酵罐。攪拌均勻后，開始發 酵控制。d間隔8 h,開啟取樣閥取樣300500ml發酵液分

18、別測定殘糖、菌濃、酸度 等數值。發酵參數到達放罐指標時，發酵結束。打開放料閥，將發酵液全部排出；放罐后用水清洗發酵罐2-3次，洗凈后通蒸汽消毒15mino培養后用干凈抹 布要清除電器箱、電纜等接頭和其他罐休部件上的物休。實驗四酵母菌分批發酵1、實驗原理發酵過程即細胞的生物反應過程，是指由生長繁殖的細胞所引起的生物反應 過程。微生物發酵的生產水平不僅取決于生產菌種木身的性能，而且耍賦以合適的 環境條件才能使它的生產能力充分表達出來。為此我們必須通過各種研究方法了 解有關生產菌種對環境條件的要求，如培養基、培養溫度、ph、氧的需求等，并 深入地了解生產菌在合成產物過程中的代謝調控機制以及可能的代謝

19、途徑，為設 計合理的生產工藝捉供理論基礎。同時，為了掌握菌種在發酵過程屮的代謝變化 規律，可以通過各種監測手段如取樣測定隨時間變化的菌體濃度，糖、氮消耗及 產物濃度，以及采用傳感器測定發酵罐中的培養溫度ph、溶解氧等參數的情況, 并予以有效地控制，使生產菌種處于產物合成的優化環境之中。2、儀器、材料和試劑(1) 儀器30l機械攪拌通氣式發酵罐；恒溫搖床；顯微鏡；分光光度計(2) 材料釀酒酵母種子；移液管；載玻片和蓋玻片(3) 培養基酵母分批發酵培養基:蔗糖5%,蛋白月東1%,硫酸鞍0.4% , kh2hp04 0. 5%, mgs04. 7h20 0. 2%,消泡劑 0. 2ml/l, ph5

20、 5。酵母菌發酵過程（操作規程見實驗三）30升發酵罐裝入20升發酵培養基,12pc滅菌30-40min,冷卻至30°c,將 培養好的搖瓶種子接入發酵罐（接種量1-5%）進行發酵。發酵條件為：溫度30°c, 攪拌轉速 250300rpm,通風量 1： 0. 5/v/v/m。過程檢測與監控：0小時：取樣測定ph、酸度、光密度od和還原糖；4-24 小時：每隔4h取樣測定ph、酸度、光密度0d和述原糖。4、實驗報告內容和數據處理根據發酵過程酵母濃度、ph、酸度和還原糖的變化規律，作出相關參數指標 隨吋間變化的曲線圖。（形態觀察見實驗五；生物量測定：利用分光光度計測 600nni處

21、酵母細胞的吸光值，可間接地反映細胞的多少，測0d值時，要迅速， 盡量避免細胞沉降所引起的誤差）實驗五酵母菌的形態觀察1、實驗原理酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，其大小通常比常見細菌大幾倍或幾十 倍。大多數酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合 產生子囊砲子。本試驗通過美藍染液水浸片合水一碘液水浸片來觀察酵母的形態 和出芽生殖方式。美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。 用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強 的述原能力，能使美藍由藍色的氧化型變為無色的述原型。因此，具有述原能力 的酵母活細胞是無色的，而死細胞或代謝作用微弱

22、的衰老細胞則呈藍色或淡藍 色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。子囊泡子是子囊菌類真菌有性生殖產生的有性泡子。在酵母菌屮，能否形成 子囊他子及其形態是酵母菌分類鑒定的重要依據之一。酵母菌形成子囊他子需要 一定的條件，所以對不同種數的酵母耍選擇適合形成子囊砲子的培養基。麥氏 (mcclary)培養基(葡萄糖一醋酸鈉培養基)有利丁釀酒酵母了囊孑包了的形成。2、儀器、材料和試劑(1) 儀器顯微鏡；超凈工作臺(2) 材料吸耳球；50ml小燒杯；玻璃棒；載玻片；蓋玻片；擦鏡紙；接種壞；酒精 燈(3) 試劑0.05%和0.1%呂氏堿性美藍染色液哥盧氏碘液3、實驗步驟美藍浸片觀察(死活細胞的觀察)(1) 在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍染色液，然后按無菌操作用接種 環挑取少量酵母菌放在染液屮，混合均勻。(2) 用鑲子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使 其蓋在菌液上。(3) 將制片放置3n)in后鏡檢，先用低背景然后用高倍鏡觀察酵母的形態和 出芽情況，并根據顏色來區別死活細胞。(4) 染色后約05h后再次進行觀察，注意死細胞數量是否增加。(5) 用0. 05%呂氏堿性美藍染液重復上述操作。(6) 對丁發酵液中的酵母細胞，可以用無菌玻璃棒醮取后直接制片觀察。比 較固體培養和液體培養的酵