1、一、血漿分離、游離DNA抽提區步驟操作內容備注試劑區1.DNA提取試劑配制 蛋白酶K+磁珠：提前30分鐘恢復到室溫。配制裂解液：裂解液（20ml）瓶中加入14ml異丙醇，顛倒混勻，室溫存放。要充分混勻配制清洗液清洗液1：用前加入25ml無水乙醇，顛倒混勻，室溫存放。清洗液2：用前加入64ml無水乙醇，顛倒混勻，室溫存放。2.蛋白酶K和磁珠的分裝 1.2ml淺孔板，排槍加：10µL混勻蛋白酶K14µL混勻磁珠 先加入蛋白酶K，后加入磁珠，加磁珠時要注意混勻。樣本制備區11.消毒 移液器、離心機、生物安全柜，試驗臺的消毒，75%酒精噴灑、擦拭。2.低速低溫分離血漿 4，1600

2、g離心10分鐘，安全柜內分離血漿,每個樣本分離出5管：3×1.6ml血漿管（其中2管用于儲存），1.6ml白細胞層儲存管（混勻分裝2×0.8ml）, 3.高速低溫分離血漿 1.6ml血漿實驗管，4，16000g離心10分鐘 ，由后向前依次轉入對應的樣本號管內（每管1.6mL）， -80保存血漿和血細胞管。4.加血漿 1.2ml淺孔板對應孔內各加入200µL高速離心分離的血漿上清。質控：陽性、陰性、空白、已檢陽性。5.加裂解液并混勻 排槍加裂解液280µL/孔(2×140µL)，每3分鐘混勻一次（吹打15次），混勻次數3次。共15分鐘，

3、注意實驗室溫度的影響。6.磁力分離 置于磁力架上5分鐘至澄清，棄上清7.清洗 7.1清洗1：用排槍加入320µL（2×160µL）清洗液1，吹打6次，置磁力架30s至澄清，棄上清。7.2清洗2：使用清洗液2，操作流程同7.1。7.3清洗3：重復7.2.清洗3結束后要充分棄除殘液并室溫晾干（使用手電筒觀察磁珠表面無反光現象即為晾干）。8.洗脫獲得核酸溶液 下磁力架，加42µL洗脫液，吹打6次，室溫5分鐘，上磁力架至澄清。若直接進行建庫則將40µL上清直接轉入裝有末端修復的PCR板或八連排；若就此停止則轉入PCR板或八連排備用。配制陰/陽對照：按1

4、.5µL原樣+38.5µL純水封板，可暫存于-20二、末端修復區步驟操作內容備注試劑區1.試劑解凍 試劑盒內試劑室溫融化，混勻瞬離酶，放冰盒待用。其它組分室溫解凍，震蕩混勻離心，冰上待用。2.在冰上配制并分裝末端修復反應混合液 配制 人份用量（1.5ml EP管，多配10%人份富余量）： ERAT Buffer Mix lERAT Enzyme Mix lMIX墊手混勻并分裝至PCR板/八連排中備用。每人份用量10ul ：ERAT Buffer Mix： 9.4ERAT Enzyme Mix：0.6樣本制備區11.加樣本 將提好的DNA與配置好的陰/陽對照轉入裝有10

5、81;L末端修復MIX的PCR板或八連排中并吹打混勻，確認液面無異常后封膜離心，進行末端修復。反應體系：50µL。2.設置修復條件 £熱蓋70，37（10min）65（15min）4 （Hold）3.末端修復反應結束 £瞬離，收集反應液至管底。末端修復產物可以放在-20過夜，但產量會下降20%。三、接頭連接區步驟操作內容備注試劑區在冰上配制接頭連接反應混合液 配制 人份用量（1.5ml EP管，多配10%人份富余量）：Ligation Buffer Mix µLLigation Enzyme µLMIX槍混或墊手混勻。每人份用量：連接緩沖液Mi

6、x 24 µL連接Enzyme 1 µL樣本制備區11.加接頭 在DNA末端修復好的PCR 板或八連排（50µL）中加入5 µL對應的 Adapters Mix (Barcode 01-48)2.加接頭連接混合液 £加入25µL配制好的接頭連接反應混合液。吹打混勻，確認液面無異常后封膜離心。反應體系80l含PEG，粘稠，需緩慢吸取。3.設置連接條件 熱蓋 OFF，23（20min）4（Hold）4.接頭連接反應結束 瞬時離心（八連排可用掌上離心機）。連接產物可以放-20過夜，但產量會下降。四、連接產物純化與PCR擴增體系建立區步驟操作

7、內容備注試劑區純化試劑準備 提前30min取出純化珠于室溫，并裝40µL/孔于1.2mL淺孔板中備用。在冰上配PCR 反應混合液 配制 人份用量：PCR Enzyme Mix： µLPCR Primer Mix： µLMIX槍混并分裝至PCR板或八連排中。每人份用量29µL：PCR Enzyme Mix 25 µLPCR Primer Mix 4 µL樣本制備區11.磁珠純化 £將連接產物轉入裝有40µL磁珠的1.2mL淺孔板中，輕輕吹打至少10次，完全混勻，最后一次應確保將吸頭中所有液體及磁珠都打入管中。2.孵育

8、 £室溫靜置10min3.棄上清 £上磁力架，靜置10min，帶溶液澄清后棄上清。4.乙醇漂洗 £淺孔板保持于磁力架上，加入180µL 新鮮配制的75%乙醇吹打6次，棄上清5.再次漂洗 重復步驟4，充分棄去殘液。6.干燥 室溫晾干，約5min,使用手電筒照射磁珠表面無反光即為干燥。7.洗脫 向淺孔板中加入23µL洗脫緩沖液，浸濕磁珠，下架，反復吹打混勻至溶液呈均一狀態。8.孵育 室溫10min，每5min進行一次吹打混勻。9.移入PCR管 置于磁力架上至澄清，取21µL上清液，加入到配制好的PCR反應液中，反復吹打混勻，反應體系50&

9、#181;L。停止點：連接產物純化后可置-20冰箱儲存。10.轉實驗區 通過室內傳遞窗轉運到擴增區1五、 PCR擴增區步驟操作內容備注擴增區11設置PCR條件 £ 熱蓋105， 98 2 min 1 循環98 15s56 15s 72 30s 12 循環72 5 min 1 循環4 Hold2轉實驗區 £擴增管經過道傳遞窗轉運到擴增區2。擴增區不能有開管操作六、文庫的純化區步驟操作內容試劑區純化磁珠的準備 提前30 min 取出純化磁珠至室溫。使用前充分震蕩混勻，排槍分裝50µL/孔磁珠至1.2mL 淺孔板。 可提前把當天要用純化試劑放在擴增區2冰箱擴增區21.移

10、入純化板 擴增后的產物瞬時離心，收集反應液至管底。將全部產物分別轉移至已分裝好50µL 純化磁珠 的1.2 mL 淺孔板中。2.磁珠吸附 £用帶濾芯吸頭輕輕吹打至少15次至完全混勻，最后一次應確保將吸頭中所有液體及磁珠都打入管中，靜置10分鐘。于磁力架吸附10分鐘至液體澄清，棄上清。3.乙醇漂洗 £于磁力架上，加入180µL 75%乙醇漂洗磁珠，吹打6次，靜置30s 后棄上清注意加乙醇時清洗孔壁4.再次漂洗 重復步驟3，充分棄去孔內殘液。5.干燥 保持純化板在磁力架上，室溫晾干（使用手電筒照射磁珠表面無反光現象即為干燥）。6.洗脫 保持淺孔板于磁力架上，

11、加32µL洗脫緩沖液浸濕磁珠表面，下架，輕輕吹打混勻，室溫靜置10分鐘，中間5分鐘混勻一次。7.移入新管 上架至溶液澄清，吸取30µL上清液轉移到新PCR板或八連排中。停止點：PCR純化后產物，可置-20冰箱儲存七、DNB制備與質檢區步驟操作內容備注試劑區準備試劑 取出環化反應緩沖液、連接酶、DNB制備緩沖液、DNB聚合酶混合液I、DNB聚合酶混合液II、TE緩沖液和DNB終止液、DNB加載緩沖液I、DNB加載緩沖液II，經PCR通道傳遞窗轉移到擴增區2連接酶、DNB聚合酶混合液II 、DNA聚合酶混合液存放于20，現用現拿。其它試劑4解凍。測序試劑板II及DNB加載試劑板

12、常溫解凍即可。測序試劑板I、測序試劑板II、DNB加載試劑板、DNA聚合酶混合液、dNTP混合液I、dNTP混合液II于試劑區融化備用，測序芯片室溫平衡，DNB加載前經PCR通道傳遞窗轉移至測序區。擴增區2.1. PCR文庫質檢加樣： 1.1 dsDNA檢測試劑配制：染料工作液配制：熒光染料/buffer=1/199染料分裝：定標管S1、S2各分裝190µL，樣本管各分裝198µL。1.2標準品S1、S2各加10µL，對應樣本管加樣2µL。1.3 U盤導出定量結果，按時間排序后導入定量表。要求最終PCR產物文庫濃度2 ng/µL。2. 混合文庫

13、與環化：pooling變性單鏈環化反應2.1根據任務單中DNA文庫定量結果，將待測文庫根據標簽接頭編號確定合適的pmoL數進行等質量混合，并使用洗脫緩沖液統一稀釋至濃度為3.33ng/L。2.2取48L混合文庫于PCR管中，置于PCR儀上95變性6min，在反應進行到5min處即刻取出PCR管插入碎冰冷卻，放入20冰箱23min后取出。2.3每個PCR管加12.1L環化反應液，混勻，瞬離5s。反應條件：熱蓋：Off，體積：60L，37，30min。直接將樣本濃度導入任務單的電子表格即可計算出各樣本需要用于POOLING的體積。每條lane用量酶：0.5µLbuffer：11.6

14、81;L每張芯片用量酶：1.1µLbuffer：25.52µL3.DNB生成3.1 取2.3步驟環化DNA文庫20µL（約6ng）到0.2 mL PCR管。加20µL DNB制備緩沖液，渦漩混勻，瞬離，置PCR儀反應條件：熱蓋：105，體積：40µL，95 1min，65 1min，40 1min，4 Hold。3.2 當溫度達到4時取出PCR管，瞬離5s，加40µL DNB聚合酶混合液I和4µL DNB聚合酶混合液II，槍混。瞬離。反應條件：熱蓋：Off，體積：84µL，30 20min，4 Hold。3.3達4

15、后立即取出PCR管置冰盒上，即刻加20µL DNB終止緩沖液，闊口吸頭滴混58次，4備用。注意：混勻DNB時一定要用闊口吸頭輕柔吹打，劇烈吹打會破壞DNB。終體積：20+20+40+4+20=104µL4.DNB質檢4.1 ssDNA檢測試劑準備：配制與分裝同dsDNA。4.2標準品S1、S2各加10µL，對應的樣本各加樣2µL。4.3 濃度8ng/µL 40ng/µL范圍內合格。<8ng/µL，重新制備； >40ng/µL（不是由于DNB反應時間過長導致），用DNB加載液I稀釋到20ng/µ

16、L。5.測序的加載準備5.1準備兩個八連排管做好標記。5.2加入32µLDNB加載緩沖液II，和1µLDNB聚合酶混合液II.5.3將上述3.3樣本全部轉入八連排中，闊口吸頭滴混58次。經過PCR過道傳遞窗轉移到測序區八、DNB加載區步驟操作內容備注測序區加載1.清洗DL-50：進行加載前對儀器進行清洗，12次，最后一次使用進行預載的底座進行清洗。2.放置芯片：檢查全自動樣品加載系統墊片、芯片底座是否正常，并將測序芯片安裝在芯片底座上，確保上下左右無法晃動。測序芯片反面定位凸起與樣品加載系統上的凹槽吻合后卡住芯片。2.放置加載試劑板：揭開試劑板封口膜，放置在加載系統試劑板位

17、（試劑標簽粘貼處應朝外）。3放置測序樣品管：將樣本放于加載系統指定DNB放置區，選擇DNB加載程序Sample2.0，點擊開始，等待加載完成。4.加載完成后，保持芯片在加載系統上室溫孵育30min。取下芯片，上機測序或存放于4冰箱備用。DNB加載過程中切勿移動芯片。九、Halos關聯信息導入區步驟內容備注測序區1、導入樣本信息表 核對信息，制作樣本信息表，點擊【樣本中心】-【導入】按鈕，導入樣本信息表2、導入Pooling信息 核對信息，制作pooling信息表，點擊【實驗中心】-【導入】按鈕，導入Pooling信息表。3、補錄關聯 核對DNB ID順序，點擊【補錄關聯】輸入相關信息，需英文字符。4、查看測序狀態 測序開始后在【實驗中心】查看測序狀態，顯示“進行”即可。十、測序區步驟操作內容備注試劑區試劑板II加試劑 5號孔位：短暫離心DNA聚合酶混合液（藍色蓋子）、震離dNTPs混合液I（棕色蓋子），各取520µL加入孔內。搖晃混勻。 6號孔位：短暫離心DNA聚合酶混合液（藍色蓋子）、震離dNTPs混合液II（白色蓋子），各取520µL加入孔內，搖晃混勻。測序區1.上機測序1.1測序儀啟動，啟動測序儀對應的內置控制程序。1.2用清洗芯片進行儀器的流道清洗（為判斷管路情況，最后一次清洗需量體積，約20mL）