1、實驗八實驗八 SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質垂直板電泳分離蛋白質一、目的要求一、目的要求1.學習電泳原理和技術2.學習和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質技術二、二、原理原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(

2、ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學性能穩定，與被分離物不起化學反應，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調節，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改

3、變單體及交聯劑的濃度調節凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質分子量密切相關。 表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續系統與不連續系統兩大類。 目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如

4、圖2)，兩者電泳原理完全相同。 圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)(1)樣品膠pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 (3)分離膠pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3 凝膠模示意圖1.樣品槽模板 2.長玻璃板 1.導線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統 返回不連續體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris

5、-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素。（1）樣品濃縮效應(a)凝膠孔徑不連續性：(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質；（c)電位梯度的不連續性：(2)分子篩效應(3)電荷效應 圖4 電

6、泳過程示意圖A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子B顯示電泳開始后，蛋白質樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區帶。C顯示蛋白質樣品分離成數個區帶。圖5 不連續系統濃縮效應示意圖 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱SDS)，則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關。因此可以利用SDS-PAGE測定蛋白質分子量。三、試劑與器材三、試劑與器材試劑：10

7、%SDS、 凝膠貯液（30ACr-0.8%Bis)、分離膠緩沖液（3.0 mol/L pH8.9TrisHCl 緩沖液）、 濃縮膠緩沖液（ 0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 緩沖液）、10%過硫酸銨、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly電極緩沖液、 1%瓊脂糖溶液、0.05考馬斯亮蘭R250 、7%醋酸器材：垂直板電泳槽、穩壓穩流電泳儀 、脫色搖床五、五、 操作方法操作方法1.安裝夾心式垂直板電泳槽 (1)裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。(2)將長、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃

8、板應面對上貯槽。(4)將下貯槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘的上貯槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。(5)豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應避免有氣泡。3. 制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液，用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1 cm。用1 mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約34 mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。 約30-60 min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。將上、下貯槽的蒸餾水倒去 ，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細長頭的滴管加到長

9、、短玻璃板的窄縫內(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5 cm處，輕輕加入樣品槽模板.在上、下貯槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。靜置電泳槽，10 min左右，上膠即可聚合，再放置10-20 min，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5 cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。 4. 樣品的處理及加樣 將樣品按0.51 mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時迸出)，在100沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。用微量進樣器取25 l上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。5 .電泳將電泳儀的正極與下槽連接，負極與

10、上槽連接，接通冷卻水，打開電泳儀開關，開始時電流為10 mA，待樣品進入分離膠后，將電流調至20-30 mA，當溴酚藍染料距硅膠框1 cm時，停止電泳，關閉電源及冷卻水。6 .染色與脫色電泳結束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，在兩側溴酚藍染料區帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。加入染色液染色1-2 h，再用脫色液脫色，直至蛋白質區帶清晰，即可計算相對遷移率。7. 結果處理量出加樣端距細銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質樣品區帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR:相對遷移率mR= 蛋白質樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍區帶中心距加樣端距離(cm)六、注意事項六、注意事項（1）安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，避免緩沖液滲漏。（2）用瓊脂