1、深圳市合一康生物科技有限公司HYK免疫細胞治療技術(shù)HYK免疫細胞治療技術(shù)是通過對單個核細胞，在GMP實驗室內(nèi)經(jīng)過添加細胞因子，使細胞數(shù)量擴增、殺瘤活性增強，再通過靜脈、介入等方式分次回輸給病人，從而激發(fā)和增強患者的免疫力，能有效清除微小殘留腫瘤細胞，延長生存期，是防止腫瘤術(shù)后和放化療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新方法。常用的腫瘤免疫細胞手段包括ECIK細胞、DC細胞、DC-CIK細胞、DCIK細胞、T細胞。HYK免疫細胞治療的途徑有哪些？HYK免疫細胞治療的途徑可分為靜脈注射、皮下注射，瘤體內(nèi)注射和淋巴結(jié)注射。HYK免疫細胞治療技術(shù)的優(yōu)勢HYK免疫細胞治療是20世紀80年代以來隨著免疫生物學(xué)、腫瘤免疫學(xué)和細

2、胞分子生物學(xué)的發(fā)展而形成的第四種治療手段，它克服了傳統(tǒng)治療“易轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)，副作用大”的缺點，具有傳統(tǒng)治療無法比擬的優(yōu)勢，具體如下：低毒：無明顯毒副作用靶向：作用方向明確，僅針對體內(nèi)異常腫瘤細胞進行殺傷，不會破壞正常的組織細胞全面：清除微小病灶和殘余腫瘤細胞，對原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移病灶和耐藥腫瘤病灶均有療效 ，能有效預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)高效：增強機體免疫功能，改善癥狀，提高生存質(zhì)量，延長生存期 。HYK免疫細胞治療的適應(yīng)癥：手術(shù)后的腫瘤患者，可防止腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；無法進行手術(shù)、放療、化療的中晚期腫瘤患者；放療、化療失敗的腫瘤患者；腫瘤患者放化療后的綜合治療，可減輕放化療的副作用；骨髓移植后或化療緩解后的白血病患

3、者；癌性胸、腹腔積液患者；部分暫不適宜做手術(shù)、介入或其他治療的患者。HYK免疫細胞治療的禁忌癥1、孕婦或者正在哺乳的婦女；2、 T細胞淋巴瘤患者；3、不可控制的嚴重感染患者；4、對IL-2等生物制品過敏的患者；5、艾滋病患者；6、正在進行全身放療、化療的患者；7、晚期腫瘤造成的惡病質(zhì)、外周血象過低患者；8、器官功能衰竭者；9、臟器移植者；10、長期使用或正在使用免疫抑制劑的患者。ECIK細胞治療技術(shù) 增強型細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（Enhanced cytokine induced killer cell, ECIK）是在普通型CIK的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化培養(yǎng)體系而獲得的較CIK細胞數(shù)量更多、殺瘤活

4、性更強的細胞。其通過采集分離到患者外周血中的單個核細胞，在體外用多種進口的細胞因子共同培養(yǎng)而獲得的一群異質(zhì)性細胞，其中以CD3+和CD56+雙陽性細胞為主要效應(yīng)細胞，兼具有T細胞特異性殺腫瘤和NK細胞非MHC限制性殺瘤的特點。E-CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、非MHC限制性、對正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點。E-CIK細胞除具有普通型CIK細胞的特性外，其顯著的特征是增殖能力是普通型CIK細胞的35倍，回輸?shù)募毎麛?shù)量達到100億以上，有利于形成殺瘤的量效優(yōu)勢。 ECIK細胞可以通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)？1 通過釋放穿孔素、顆粒酶等物質(zhì)直接殺傷腫瘤細胞。2 通過Fas/Fas

5、L途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。3 通過分泌IFN-、TNF-、IL-2、IL-6等多種細胞因子，發(fā)揮直接或間接的抗腫瘤免疫效應(yīng)。ECIK細胞抗腫瘤免疫治療的優(yōu)勢？1 ECIK細胞增殖速度快，可以在短期內(nèi)大量擴增，滿足臨床治療的需要。2 ECIK細胞具有特異性識別腫瘤細胞的機制，對正常細胞無毒副作用。3 ECIK細胞殺瘤活性高，殺瘤譜廣，對多種耐藥腫瘤細胞同樣敏感。4 ECIK細胞殺瘤活性不受CsA（環(huán)孢霉素A）和FK506（普樂可復(fù)）等免疫抑制劑的影響。5 ECIK細胞是活化的自體細胞，安全性好，不會產(chǎn)生排斥等反應(yīng)，副反應(yīng)小。 ECIK 的治療范圍ECIK細胞能治療哪些腫瘤？由于ECIK細胞對任何

6、一種腫瘤均有殺傷作用，在多種腫瘤的治療中展示了應(yīng)用前景。如各種肉瘤、黑色素瘤、惡性淋巴瘤、腎癌、非何杰金氏淋巴瘤及高分化腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、消化道腫瘤（如胃癌、結(jié)腸癌、食道癌）、胰腺癌、喉癌、頭頸部腫瘤、淋巴瘤（T細胞淋巴瘤除外）、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等。有些腫瘤，如各種肉瘤、黑色素瘤、腎癌、非何杰金氏淋巴瘤及高分化腺癌等對放化療不敏感，因此ECIK細胞是這些腫瘤的首選。 ECIK細胞治療可用于哪一階段（期）的腫瘤？ECIK細胞治療可用于任何一期的腫瘤患者，早期、中晚期的病例均有較好的近期療效。手術(shù)切除、介入、射頻、氬氦刀等治療的同時或治療后的病人療效更佳。ECIK細胞能

7、夠殺傷清除不能用手術(shù)切除的極微小瘤灶或是體內(nèi)散存的腫瘤細胞，起到延緩或阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的作用。部分暫時不適宜做手術(shù)、介入或其它治療的患者，也可以先進行免疫細胞治療，提高身體機能狀況，改善生活質(zhì)量，爭取其它治療機會。 DiKaT細胞治療技術(shù)載瘤抗原樹突狀細胞（Tumor associated antigen-Dendritic cell, TAA-DC）激活CIK及特異T細胞整合技術(shù)（Integrated dendritic cell induced killer cell and T cell, DiKaT），根據(jù)病人HLA-a2分型檢測陽性的病人，選用病人腫瘤相應(yīng)的特異性抗原（TSA）負

8、載DC，并分別用DC來激活病人的CIK、T細胞，DiKaT技術(shù)是綜合了DC疫苗、CTL細胞治療等技術(shù)，進行序貫聯(lián)合設(shè)計的一種個性化細胞治療技術(shù)。DiKaT技術(shù)采用多種免疫細胞聯(lián)合作用，克服了單一免疫細胞治療的局限性，結(jié)合了特異性殺傷和非特異性殺傷腫瘤細胞的效果，可全面提高病人的免疫功能，對免疫原性較強的腫瘤效果更好。另外接受本治療前必須進行HLA-a2分型檢測，檢測結(jié)果陽性患者適合該技術(shù)治療。 T細胞治療技術(shù)T細胞是介于特異性免疫與非特異性免疫之間的一種特殊類型的細胞，主要分布于皮膚和粘膜組織，一般不超過T細胞總數(shù)的5%。活化后的T細胞具有強大的特異性和非特異性殺傷腫瘤細胞的雙重特性，此外T細

9、胞還具有DC的抗原遞呈能力，可高效激活T細胞形成CTL細胞；HYK的專利技術(shù)能在體外高效擴增T細胞，從而解決有效細胞量不足和DC抗原遞呈細胞無法擴增的缺點。 D-CIK細胞治療技術(shù) 樹突狀細胞調(diào)節(jié)的細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（Dendritic cell activated and cytokine induced killer cell, D-CIK），是將人體外周血單個核細胞分別誘導(dǎo)培養(yǎng)成DC和CIK細胞，DC培養(yǎng)成熟后再與CIK細胞共培養(yǎng)而獲得的異質(zhì)性細胞群體。二者共培養(yǎng)時，T細胞促使DC進一步成熟后釋放大量IL-12、IFN-等細胞因子，使CIK細胞對腫瘤細胞的細胞毒活性明顯增強，CIK細

10、胞擴增倍數(shù)上升；DC分泌高水平的IL-2、IL-12誘導(dǎo)Th1型細胞免疫應(yīng)答，有利于清除腫瘤細胞，達到1+1>2的效果。一、TIL細胞治療技術(shù)腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL細胞）是一群存在于腫瘤間質(zhì)中的異質(zhì)性淋巴細胞，一般從腫瘤組織、腫瘤引流淋巴結(jié)、癌性胸腹水中分離出的淋巴細胞經(jīng)IL-2培養(yǎng)得到，其腫瘤殺傷活性為MHC限制性，即為自體腫瘤特異性殺傷細胞，具有CD3+CD8+或CD3+CD4+表面標志。TIL細胞對癌性胸、腹腔積液患者療效顯著。TIL細胞治療腫瘤的優(yōu)點增殖性及殺傷性強；IL-2量用量小；取材于腫瘤組織。對癌性胸水和腹水

11、治療效果較好。 二、CTL細胞治療技術(shù)CTL細胞技術(shù)CTL(cytotoxic T lymphocyte)細胞即細胞毒性T淋巴細胞，它在T細胞免疫應(yīng)答中起重要作用。CTL的功能特點是可以在MHC限制的條件下，直接、連續(xù)、特異性的殺傷靶細胞。CTL對靶細胞的殺傷過程可以分為三個時相：（1）接觸相：CTL通過TCR及粘附分子與靶細胞接觸。此過程只需要幾分鐘。（2）分泌相：CTL與靶細胞緊密結(jié)合，CTL活化并使細胞顆粒性內(nèi)容物呈現(xiàn)極化分布，隨即啟動胞吐機制，分泌細胞毒性物質(zhì)，作用于靶細胞。（3）裂解相：靶細胞死亡的過程。CTL的殺傷特點：（1）殺傷力強；（2）反復(fù)殺傷靶細胞，而且在殺傷靶細胞的過程中

12、本身不受損傷；（3）MHC限制性。CTL的殺傷機制：（1）穿孔素：穿孔素以單體形式釋放后，插入靶細胞膜，形成管狀多聚穿孔素（孔道），容許Na+和水分子進入靶細胞， 使靶細胞滲透壓改變，最終導(dǎo)致靶細胞溶解。（2）顆粒酶：CTL細胞通過胞吐作用釋放的顆粒酶，可通過穿孔素構(gòu)建的管狀結(jié)構(gòu)穿越靶細胞膜進入其胞漿中，激活caspase10（半胱天冬氨酸蛋白酶10），引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，使靶細胞凋亡。（3）腫瘤壞死因子：包括TNF-和TNF-，它們可以與靶細胞表面的相應(yīng)的受體結(jié)合，啟動靶細胞的凋亡。CTL療法1. Tc細胞簡介CD8+T細胞又稱細胞毒性T（Tc或CTL）細胞，能直接攻擊帶異抗原的靶細

13、胞，因此在抗病毒感染、同種異體移植排斥反應(yīng)和抗腫瘤免疫中起重要作用。2. Tc細胞的作用機制Tc細胞對靶細胞的殺傷作用是抗原特異性的，只殺傷相應(yīng)靶細胞而對其它細胞無損傷作用。Tc細胞殺傷靶細胞的過程分為兩個階段。（1） 效靶細胞結(jié)合階段Tc細胞到達抗原所在部位后，通過TCR-CD8復(fù)合物與靶細胞表面抗原肽-MHCI類分子復(fù)合物緊密結(jié)合，并在多種粘附分子、細胞因子等參與下，完成復(fù)雜的識別、粘附、信號傳遞等過程，觸發(fā)細胞活化釋放溶細胞介質(zhì)。（2） 致死性打擊階段（殺傷主要機制）Tc細胞主要通過三種方式殺傷靶細胞。穿孔素-顆粒酶系統(tǒng)途徑Tc細胞釋放顆粒中預(yù)先合成的穿孔素和顆粒酶。穿孔素以單體形式釋放

14、后，插入靶細胞膜，形成管狀多聚穿孔素（孔道），容許Na+和水分子進入靶細胞， 使靶細胞滲透壓改變，最終導(dǎo)致靶細胞溶解。另一方面為顆粒酶進入靶細胞提供通道。顆粒酶是一類絲氨酸酯酶， 具有核酸酶效應(yīng)。從顆粒中釋放后經(jīng)多聚穿孔素進入靶細胞，在靶細胞內(nèi)觸發(fā)引起DNA斷裂的機制，導(dǎo)致靶細胞調(diào)亡。由于顆粒中的物質(zhì)是預(yù)先合成的，所以這一途徑引起的殺傷是非常迅速的。效應(yīng)細胞顆粒中儲存的穿孔素和顆粒酶數(shù)量使得一個效應(yīng)細胞足以連續(xù)殺傷許多細胞。FasL/Fas系統(tǒng)途徑效應(yīng)Tc細胞殺傷靶細胞的另一種方式是通過與靶細胞的直接接觸，活化的CTL膜上表達FasL，它與靶細胞膜上的Fas結(jié)合，導(dǎo)致靶細胞調(diào)亡。細胞因子途徑效

15、應(yīng)Tc細胞分泌TNF-和TNF-，殺傷靶細胞。3. Tc細胞的臨床應(yīng)用Tc細胞在抗腫瘤和抗病毒性感染（如肝炎）治療方面有很好的應(yīng)用。Tc細胞是殺傷白血病細胞的關(guān)鍵性效應(yīng)細胞，因而將體外誘導(dǎo)并擴增的白血病細胞特異性Tc細胞回輸給患者，是一種有效的白血病治療方法。精密制導(dǎo)、精準打擊的抗癌生物導(dǎo)彈 合一康CAR-T技術(shù) 技術(shù)背景： 生物免疫細胞治療已經(jīng)成為手術(shù)、放療、化療外的第四種治療腫瘤的手段，并將成為未來腫瘤治療必選手段2012年國際細胞治療協(xié)會年會。免疫細胞治療是采集患者外周靜脈血，在GMP實驗室內(nèi)分離外周血單個核細胞，在多種細胞因子誘導(dǎo)下，大量擴增出具有高效抗瘤活性的免疫效應(yīng)細胞，再通過靜脈

16、、皮內(nèi)注射、介入等回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，達到增強患者免疫功能和殺傷腫瘤細胞的目的，常用的免疫細胞治療手段包括CIK、DC、TIL、DC+CIK 細胞等。但是，在臨床上發(fā)現(xiàn)腫瘤時，一般已是中晚期，此時病人體內(nèi)腫瘤細胞占優(yōu)勢，嚴重損害了機體的免疫功能，在這樣的免疫系統(tǒng)微環(huán)境下，DC細胞功能受損，激活T細胞效率較低，攻擊癌細胞能力不夠，也不夠精準；另外，腫瘤細胞通過低表達或不表達MHC分子的逃逸機制，逃脫免疫細胞的攻擊。這就需要制造精密制導(dǎo)、精準打擊的免疫細胞武器，克服MHC介導(dǎo)的殺瘤機制。于是，靶向性抗腫瘤細胞CAR-T技術(shù)應(yīng)運而生。2011年8月10日，美國生物轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊權(quán)威雜志報道，

17、賓夕法尼亞大學(xué)基因治療專家卡爾·朱恩利用患者改造后的自身T細胞治愈了兩位晚期慢性淋巴細胞白血病（血癌）患者，開創(chuàng)了腫瘤生物治療的新紀元。 美國科學(xué)家們對以往的治療方式做了一點小改動：首先抽出患者體內(nèi)的部分T細胞，在體外進行了基因改造，導(dǎo)入識別腫瘤的基因，形成識別腫瘤的“記憶”，并在體外短時間內(nèi)大量繁殖，最后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，長期待續(xù)殺滅全部惡性腫瘤細胞。治療進行得非常成功，一名不愿透露姓名的64歲病人在接受T細胞植入僅僅23天后，體內(nèi)的癌細胞奇跡般的全部消失了。一年之后，其中兩位體內(nèi)的癌細胞均已全部殺滅，另外一位受試者體內(nèi)的白血病細胞數(shù)量也大幅度減少。 CAR-T技術(shù)原理： 嵌合抗原受

18、體T細胞（CAR-T細胞）是將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與CD3-鏈或FcRI的胞內(nèi)部分在體外偶聯(lián)為一個嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染患者的T細胞，使其表達嵌合抗原受體(CAR)。患者的T細胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的CAR-T細胞。 圖一 第一代CAR由識別腫瘤表面抗原的單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）和免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常為CD3-和FcRI）組成。早期的實驗證明了CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引

19、起短暫的T細胞增值和較低的細胞因子分泌，不能提供長時間的T細胞擴增信號和持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。依照T細胞活化的雙信號學(xué)說，T細胞的激活和增殖需要共刺激信號； 第二代、第三代CAR引入了共刺激分子信號序列（costimulatory molecule，CM），旨在提高T細胞的細胞毒活性、增殖性與存活時間，促進細胞因子的釋放（如圖二）。 圖二 CAR-T技術(shù)優(yōu)勢：CAR-T細胞治療技術(shù)具有如下優(yōu)勢：· 治療更精準。由于CAR-T 細胞是應(yīng)用基因修飾病人自體的T細胞，利用抗原抗體結(jié)合的機制，能克服腫瘤細胞通過下調(diào)MHC分子表達以及降低抗原遞呈等免疫逃逸，讓腫瘤細胞無所逃遁；· 多

20、靶向更精準。CAR既可以利用腫瘤蛋白質(zhì)抗原，又可利用糖脂類非蛋白質(zhì)抗原，擴大了腫瘤抗原靶點范圍，CAR-T細胞作用過程不受MHC的限制；· 殺瘤范圍更廣。鑒于很多腫瘤細胞表達相同的腫瘤抗原，針對某一種腫瘤抗原的CAR基因構(gòu)建一旦完成，便可以被廣泛利用；· 殺瘤效果更持久。新一代CAR結(jié)構(gòu)中加入了促進T細胞增殖與活化的基因序列，能保證T細胞進入體內(nèi)后還可以增殖，CAR-T細胞具有免疫記憶功能，可以長期在體內(nèi)存活。卡爾·朱恩說，這些T細胞的好處在于不必像化療藥物那樣持續(xù)給藥，細胞是“活的、動態(tài)的、不斷分裂的藥”，一次注射，持久保護，這種前沿腫瘤生物治療技術(shù)讓全球的科學(xué)

21、家們震驚。 合一康CAR-T技術(shù)合一康生物通過選擇不同的共刺激分子及其組合，優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建了基于慢病毒載體轉(zhuǎn)染體系的靶向特定腫瘤抗原的第三代CAR，掌握了新一代高效、精確、可控的CAR-T細胞治療技術(shù)。同時，合一康生物聯(lián)合中科院深圳先進技術(shù)研究院成立了腫瘤免疫細胞與基因治療技術(shù)聯(lián)合實驗室，積極尋求更為安全的基因修飾載體，開發(fā)出了基于微環(huán)DNA（MC）技術(shù)的MC-CAR-T細胞治療技術(shù)。微環(huán)DNA是世界上最好的基因載體，與現(xiàn)有的基于病毒載體的技術(shù)相比，具有轉(zhuǎn)染率高、基因表達持久的優(yōu)點、同時具有非病毒載體毒性低、免疫反應(yīng)低，攜帶基因不整合至宿主細胞基因組等優(yōu)點。由此，可以發(fā)展出一系列安

22、全、高效、廣譜的、可負擔(dān)的抗癌產(chǎn)品，成為治療幾乎所有癌癥的利器。產(chǎn)業(yè)化的實施將大大降低治療的成本，提高治療的效果，不僅可以徹底治愈癌癥，甚至可以將人類帶入到一個無癌的世紀。 合一康CAR-T技術(shù)適應(yīng)癥· 適用條件一、腫瘤標志物或免疫組化檢測的某種或數(shù)種腫瘤相關(guān)抗原為陽性（參見腫瘤患者篩選標準）； 二、腫瘤組織的HLA-類抗原陽性； 三、停止化療或放療，外周血細胞恢復(fù)至正常值或接近正常值（使用升白細胞藥物達到的正常值除外）； 四、無重度貧血，全身器官衰竭和惡病質(zhì)狀態(tài)；五、肝腎功能正常，生命體征基本正常； 六、無嚴重過敏體質(zhì)； 患者符合以上條件即可接受合一康CAR-T技術(shù)治療。·

23、; 適用治療早期患者術(shù)中或術(shù)后的治療晚期患者放化療同時治療或放化療后的序貫治療晚期患者的獨立治療合一康CAR-T技術(shù)應(yīng)用范圍廣泛，針對某種或數(shù)種腫瘤相關(guān)抗原陽性的肺癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、鼻咽癌、食道癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤等惡性腫瘤均可治療。 第二篇CAR-T技術(shù)原理 嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）是將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與CD3-鏈或FcRI的胞內(nèi)部分在體外偶聯(lián)為一個嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染患者的T細胞，使其表達嵌合抗原受體(CAR)。患者的T細胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的CAR-T細胞。 圖一 第一代CAR由識

24、別腫瘤表面抗原的單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）和免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常為CD3-和FcRI）組成。早期的實驗證明了CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暫的T細胞增值和較低的細胞因子分泌，不能提供長時間的T細胞擴增信號和持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。依照T細胞活化的雙信號學(xué)說，T細胞的激活和增殖需要共刺激信號。 第二代、第三代CAR引入了共刺激分子信號序列（costimulatory molecule，CM），旨在提高T細胞的細胞毒活性、增殖性與存活時間，促進細胞因子的釋放（如圖