1、電泳原理與技術(shù)n移動界面電泳(moving boundary electrophoresis)n區(qū)帶電泳(zone electrophoresis)n穩(wěn)態(tài)電泳(steady state electrophoresis)其中以區(qū)帶電泳為目前常用的電泳系統(tǒng)。依據(jù)技術(shù)原理，電泳可分三種形式:任何電泳技術(shù)方法，均是以某種載體或支持介質(zhì)作為樣品中蛋白質(zhì)的泳動跑道，在一定溫度、ph條件下、穩(wěn)定的靜電場中實(shí)現(xiàn)對樣品中蛋白質(zhì)的分離，進(jìn)而進(jìn)行分析。電泳支持介質(zhì)必須具有：化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學(xué)穩(wěn)定性好、均勻、重復(fù)性好、電內(nèi)滲小等特性。常見凝膠電泳的支持介質(zhì)：聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylami

2、de gel, pag)由丙烯酰胺和交聯(lián)劑n，n-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成。未交鏈的單體丙烯酰胺屬神經(jīng)性毒素，并具有致癌作用，實(shí)驗(yàn)過程注意盡可能避免中毒。實(shí)驗(yàn)過程簡單，儀器設(shè)備叫貴重，但分辨率很高，重復(fù)性強(qiáng)。主要用于蛋白質(zhì)、酶、小分子核酸等分離分析。瓊脂糖凝膠：從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結(jié)構(gòu)大部分是由1，3連接的-d吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水-d吡喃半乳糖交替形成。試劑昂貴，方法簡單，分辨率較高。主要用于dna分離分析。淀粉凝膠：15%淀粉凝膠作為載體可對一定分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效分離。成本低，簡單。主要用于同工酶等分離分析。一、醋酸纖維薄膜電泳1.操

3、作技術(shù)要領(lǐng)：(1).醋酸纖維薄膜前處理(2).點(diǎn)樣：點(diǎn)樣23l；點(diǎn)樣量多少直接影響分離效果，控制點(diǎn)樣量是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。點(diǎn)樣位置合理：距離薄膜一端約2cm樣線上平行點(diǎn)樣，23個樣點(diǎn)基本保持在一條線上。商品薄膜在ph8.6巴比妥緩沖液浸泡1h以上。取出后，小塊濾紙對折吸取薄膜表面多余的緩沖液，進(jìn)行點(diǎn)樣。(3).醋酸纖維薄膜置于電泳槽樣點(diǎn)一端貼陰極鹽橋(黑線端)，非點(diǎn)樣端置于陽極鹽橋(紅線)排除氣泡壓實(shí)(確保薄膜與電極接觸良好)。(4).電泳：80100v；3550min。ph8.6巴比妥緩沖液培養(yǎng)皿醋酸纖維薄膜-+點(diǎn)樣線懸空切勿接觸(近)濾紙(5).染色薄膜浸泡于氨基黑溶液中510min。(6)

4、.脫色薄膜浸泡于漂洗液中進(jìn)行漂洗，至背景為乳白色。(7).薄膜干燥(8).透明薄膜浸泡于透明液中1030s，及時取出貼于干凈玻板上，排氣泡。慢加熱，逐步烘干。(9).分析薄膜從玻板上取下，進(jìn)行分析。alb(清蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白薄膜置于烘箱完全干燥。- -+ +alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白各組分構(gòu)成白蛋白1-酸性糖蛋白；1-抗胰蛋白酶；hp；cp；-巨球蛋白；脂蛋白；轉(zhuǎn)鐵蛋白；補(bǔ)體系統(tǒng)；脂蛋白igg；igm；iga；igd；ige 正常參考值alb：57%68%1：1.0%5.7%2：4.9%11.2%：7%13%：9.8%18.2%凝膠成像系統(tǒng)拍

5、照及掃描分析結(jié)果2.醋酸纖維薄膜電泳分離人血清蛋白質(zhì)原理蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)相對分子量(kd)alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白4.645.065.065.126.857.36920030090150156950- -+在ph8.6條件下血清中哪種蛋白質(zhì)在電場中向陽極移動最快？- - - - - - - - - - - - - - - - - - -分子量相同時，帶負(fù)電荷越多者移動較快；相同等電點(diǎn)時，分子量較小者向異極移動較快。1比2球蛋白分子量小，向陽極移動快！alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白- -+ +%57-722-54-96-1212-20polyac

6、rylamide gel electrophoresis二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)不同蛋白質(zhì)由于帶電性質(zhì)、分子顆粒大小及形狀不同，在聚丙烯酰胺凝膠(pag)中，向異極泳動速度快慢不同，經(jīng)過電泳最終被分開。由于蛋白質(zhì)在凝膠系統(tǒng)分離過程中存在濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，因此，page法是分離、分析蛋白質(zhì)較好的技術(shù)方法之一。（一）page技術(shù)流程簡介2.制膠1.組架3.點(diǎn)樣4.電泳5.染色6.脫色7.分析玻板膠條u型玻板封膠分離膠溶液濃縮膠溶液插入梳子+-電極緩沖液電極緩沖液通常采用過硫酸銨或核黃素來引發(fā)該過程,以n,n,n,n-四甲基乙二胺(tetranmethylenediamine

7、,temed)為增速劑。該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實(shí)質(zhì)是自由基催化的氧化-還原過程。其結(jié)果是液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹鸩侥z凝的半固體狀態(tài)。凝膠形狀取決于模具。（二）丙烯酰胺凝膠聚合原理與凝膠結(jié)構(gòu)ch2=chc=onh2ch2=chc=onh2ch2nhc=och2=ch甲叉雙丙烯酰胺+丙烯酰胺膠聯(lián)單體膠聯(lián)劑過硫酸銨temed聚丙烯酰胺凝膠具備立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-c=onh2c=onhch2nhc=oc=onh2c=onh2c=onh2-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-c=onhch2立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中網(wǎng)眼大

8、小與凝膠濃度相關(guān):總膠濃度(%)平均孔徑(nm)bis(鉸鏈劑)占總膠的百分?jǐn)?shù)1515256.58.010.012.015.02402301901701401901601409070280240200360300膠濃度t=a+bm100%膠聯(lián)度c=ba+b100%a:丙烯酰胺(單體)的量(g)b:甲叉雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)的量(g)m:a+b所在緩沖溶液總體積(ml)凝膠內(nèi)均勻的立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖凝膠中網(wǎng)眼的大小與膠的濃度有關(guān)，膠的濃度越小，其網(wǎng)眼越大，膠的濃度越大網(wǎng)眼越小。一般常規(guī)膠濃度為8%-10%。分離分析較小的蛋白質(zhì)分子時用較高濃度的凝膠，而分離分析分子量較大的蛋白質(zhì)時則用較大濃度的凝

9、膠。凝膠濃度t(c=2.6%)分子量范圍(kda)凝膠濃度t(c=5%)分子量范圍(kda)53020056070010151001022280151050151020020215205150凝膠濃度與有效分離蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系n分離膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，樣品仍留在加樣位置；n分離膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子受到的分子篩效應(yīng)減小，不能得到很好的分離；因此實(shí)驗(yàn)過程需要根據(jù)樣品中被分析的蛋白質(zhì)分子大小適當(dāng)進(jìn)行設(shè)計(jì)。引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導(dǎo)致聚合速度慢；濃度過大則易導(dǎo)致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在4060分鐘內(nèi)

10、完成。系統(tǒng)ph值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳ph值，以獲得最佳的聚合結(jié)果；溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；（三）影響凝膠聚合速度主要因素（四）page分離蛋白質(zhì)原理pag系統(tǒng)電泳分離蛋白質(zhì)具有很高的分辨率，因?yàn)樵撓到y(tǒng)工作狀態(tài)下存在三種效應(yīng)，這三種效應(yīng)與凝膠系統(tǒng)ph不連續(xù)性及凝膠網(wǎng)眼大小有關(guān)。1.濃縮效應(yīng)電極緩沖液tris-hcl(ph8.5)濃縮膠為的ph6.5，通電后樣品中的各種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會在快離子(cl-)和慢離子形成的高壓帶之間初步分開并形成很窄

11、的條帶，而整個樣品中的蛋白質(zhì)在將進(jìn)入分離膠時會形成一條細(xì)線，即被濃縮之效果。2.電荷效應(yīng)3.分子篩效應(yīng)樣品+ +- -甘氨酸緩沖液濃縮膠(網(wǎng)眼大)甘氨酸緩沖液分離膠(網(wǎng)眼小)ph8.5ph6.5ph8.9玻板組成的三明治模具(1mm厚)電泳槽2.電荷效應(yīng)3.分子篩效應(yīng)在設(shè)置好的濃縮膠及分離膠特定ph條件下，不同蛋白質(zhì)所帶電荷多少不同，并在穩(wěn)定的靜電場中向異極泳動的動力所決定的泳動速度不同，最終會被分離。分離膠內(nèi)屬于立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子量較大的蛋白質(zhì)顆粒向異極泳動受到的阻力較大，泳動較慢，而分子量較小的蛋白質(zhì)則阻力較小，向異極涌動較快，最終被分開。（五）影響蛋白質(zhì)泳動速度及分離效果主要因素1.系

12、統(tǒng)的ph值凝膠體系及電極緩沖液的ph決定樣品中蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，直接影響蛋白質(zhì)的電泳方向和泳動速度。ph一般設(shè)置成大于樣品中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)均荷負(fù)電，電泳方向朝陽極。而當(dāng)ph小于樣品中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，則所有蛋白質(zhì)分子荷正電，靜電場中向陰極泳動。前一種電泳系統(tǒng)屬于堿性電泳，后者成為酸性電泳。2.電場強(qiáng)度普通電泳高壓電泳520v/cm電壓降(電位梯度)。70200v/cm電壓降(電位梯度)。直接影響蛋白質(zhì)泳動速度的主要因素。3.溫度電泳過程中由于電流作用致使凝膠發(fā)熱，熱效應(yīng)對電泳有很大影響。溫度升高時介質(zhì)粘度下降，分子熱運(yùn)動加劇，自由擴(kuò)散變快，有效遷移率增加，但對于蛋白質(zhì)分離不利。另外較高

13、溫度會使凝膠變形，分子篩效應(yīng)降低，影響分離。因此，一般要求在15-25之間進(jìn)行電泳效果較好。4.電滲作用電泳介質(zhì)或支持物(如凝膠)在電極緩沖液中吸附帶電離子，使溶液相對帶電，進(jìn)而在電場作用下，溶液就會向一定方向移動，這種想象稱為電滲現(xiàn)象。帶電溶液的移動會影響蛋白質(zhì)的泳動。sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis三、三、sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)蛋白質(zhì)受還原劑作用解開二硫鍵，同時受sds作用處于變性狀態(tài)，在聚丙烯酰胺凝膠中，向亦極泳動速度快慢主要是按照分子顆粒從小到大小依次排開得以分離

14、的技術(shù)方法。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳設(shè)備簡單、操作簡便、快速、重復(fù)性好、樣品無需純化。由于同時存在三種效應(yīng)，因此分辨率和檢出靈敏度高。技術(shù)主要特點(diǎn)：技術(shù)主要應(yīng)用范圍：除了分離分析蛋白質(zhì)亞基種類、表達(dá)劑量之外，還可用于測定未知蛋白質(zhì)亞基分子量。（一）sds-page 分離基本原理蛋白質(zhì)分子的解聚sds是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)；而強(qiáng)還原劑，如二硫蘇糖醇、-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入sds和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與sds結(jié)合

15、后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-sds膠束，所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質(zhì)-sds聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。因此，sds-page過程中蛋白質(zhì)分子在凝膠中的泳動速度主要取決與亞基的分子量大小。與page技術(shù)方法相似，蛋白質(zhì)亞基在電泳過程中存在三效應(yīng)。蛋白質(zhì)樣品用sds處理后亞基的解聚和分子形狀的改變：（二）未知蛋白質(zhì)分子量的測定以不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行sds-page電泳得到不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳遷移率，制作標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進(jìn)行sds-page電泳，測定遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的分子量；相對遷移距離(relative migration,cm)logmr