1、華中農業大學本科畢業論文外文翻譯一株新的嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H49-1的產角蛋白酶的條件優化 原文來源：J.D. Liang，Y.F. Han，J.W. Zhang et al .Optimal culture conditions for keratinase production by a novel thermophilic Myceliophthora thermophila strain GZUIFR-H49-1Journal of Applied Microbiology 110, 871880. 摘要目標：為了研究培養基成分和培養條件對一株新的嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H4

2、9-1產角蛋白酶產量的影響。方法和結果：有產角蛋白酶活性的嗜熱菌株GZUIFR-H49-1通過形態學分析和ITS1-5.8S-ITS2rDNA 引物進行分子分析，確定其為一株嗜熱毀絲真菌。通過單因素實驗分析得出，在培養基的成分檢測中，淀粉，尿素，硫代硫酸鈉，氯化鈣分別是最有效的碳源，氮源，硫源和金屬離子。通過PlackettBurman設計得出尿素和pH值是對酶活有罪顯著性影響的兩個因素。產酶條件通過BoxBehnken 設計進一步優化后，最終使角蛋白酶活性從最初的800U/L提高到5100U/L,得到了6.4倍的提升。結論：本研究說明，最優化設計能夠為培養基和培養條件的優化提供實用且非常有力

3、的工具。嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H49-1是一株有作為角蛋白酶產業化菌株的能力。本研究的意義和影響：本研究鑒定了一株有潛力用來得到角蛋白產物的嗜熱菌株GZUIFR-H49-1。產角蛋白酶條件的最優化實驗和方法為新型真菌的開發和應用提供了思路。前言干重中含有80-90%角蛋白的羽毛(Ghosh et al. 2008)是禽類生產工業中的一個主要廢物。世界各地每年都會產生幾百萬噸的禽類羽毛(Szabo et al.2000; De Azeredo et al. 2006)。這種富含角蛋白的廢物有很大的潛力作為動物飼料中蛋白質和氨基酸的來源。因為飼料蛋白來源的短缺，禽類羽毛廢物已經被作為一種限制性

4、蛋白質飼料來添加到飼料中去。然而，當前的工廠中使用物理和化學方法獲得的羽毛粉對環境不友好，還會破壞氨基酸組成，動物難消化，營養品質與產品收益不穩定(Sangali and Brandelli 2000; Mabrouk 2008)。幸運的是，當把來自微生物的角蛋白酶和有角蛋白酶活性的微生物用來降解時，這些問題就可以迎刃而解，從而把廢物變為產品(Riffel and Brandelli 2002; Cao et al. 2008)。角蛋白是最豐富的不溶性結構纖維狀蛋白質，也是頭發、 指甲、 角、 毛、 皮膚和羽毛的主要成分。它不能通過酸、 堿等化學試劑和常見的蛋白水解酶，如胰蛋白酶、 胃蛋白酶和

5、木瓜蛋白酶等輕松降解的，但很容易被蛋白酶所降解(Balaji et al. 2008; Mabrouk 2008)。角蛋白酶產物通常可以被角蛋白所誘導。在含有角質的底物，如羽毛中，有角蛋白酶活性的微生物可以被誘導生成大量角蛋白酶。更有趣的是，角蛋白酶可以廣泛應用于農業、 工業、 生物醫學、 生物能源和其他領域，例如，飼料、 家禽加工、 紡織品、 皮革、 美國進口、 化妝品和生物轉化的處理等。這種酶可以用于羽毛轉化為增值性產品，包括動物飼料、 肥料、 膠水、 薄膜和鋁箔等。可生產角蛋白酶的微生物已發現幾種不同的微生物種類，包括真菌、 細菌和放線菌。據報道在真菌中，一大批高產蛋白酶菌株存在于皮膚寄

6、生性真菌和一些其他屬中。然而，嗜熱真菌的最低生長溫度為20，最高為50，且鮮有報道其可以產生角蛋白酶。與嗜溫菌相比，嗜熱菌可能會有優勢，因為其加速的反應過程和生物量與酶的積累減少了工業活動中污染的風險。從嗜熱菌株中得到的酶也往往比那些從嗜溫菌中得到的有更大的穩定性。培養基及培養條件的優化對酶的生產起著至關重要的作用。角蛋白酶生產菌株受許多因素如溫度，pH值和培養基中的碳，氮源的性質所影響。此外，這些因素在不同的物種中有不同的影響。所以，就必須優化可以使角蛋白酶超量生產的培養基成分和培養條件。通過y因素設計及響應面分析來優化也是一種獲得最佳的工藝條件重要的途徑。在本報告中，我們確定和描述一株分離

7、到的新型的可快速生長的有角蛋白酶活性的嗜熱真菌，然后通過優化各種培養基及培養條件的響應面方法來提高蛋白酶活性。1 材料和實驗方法1.1樣品收集和菌株分離本實驗中采用的嗜熱毀絲真菌GZUIFR-H49-1是從中國四川省綿陽市的辣椒根際土壤中收集和分離到的。先將土樣在三角瓶中加無菌水用力搖勻，再將土壤懸液涂布于由羽毛粉作為主要碳源和氮源的M培養基中，37中培養。挑取單菌落，涂于PDA斜面事關，4保存于貴州大學真菌資源所。1.2菌株鑒定1.2.1形態學鑒定 將菌株GZUIFR-H49-1接種在PDA上，35生長2.5天后，通過菌落特征，菌絲結構和生長溫度來鑒定。1.2.2分子鑒定 Taq酶和dNTP

8、來自于上海三公公司。將菌株GZUIFR-H49-1在PDA平板上孵化后，取新鮮的菌絲用于DNA 的提取。提取的DNA咋-20冰箱保存。ITS區域包含5.8S rDNA，可以用引物ITS5和ITS4來擴增。第一輪的變性溫度為94，5分鐘，擴增過程需要35個循環，循環中變性溫度9440s，退火溫度為4940s，延伸溫度為7260s，最后一個延伸步驟需要7210分鐘。PCR產物通過UNIQ-10PCR產物純化柱進行純化。菌株GZUIFR-H49-1的ITS5.8S-ITS4區域核酸序列同基因庫中相近來源的真菌的序列進行對比分析后，對引物進行修改。1.3羽毛處理： 雞的羽毛來自于養殖場的處理廢物。首先

9、，將羽毛在1%的清潔劑中浸泡12小時，再用蒸餾水洗滌10-20分鐘直至干凈。接著，在60攝氏度烘干后，最后粉碎后過一毫米孔徑的篩子。1.4培養基用于激活的基礎培養基含：羽毛粉20；NaCl, 0.5; KH2PO4, 1.0 and K2HPO4, 6.0 at pH 7.5. PDA培養基用于菌種的鑒定和培養。1.5產酶菌株接種于裝有50ml的液體培養基的250ml錐形瓶中，置于37攝氏度搖床中120轉每分鐘培養。粗酶液經過濾紙過濾后在8000rpm離心5分鐘。1.6角蛋白酶活測定酶活測定方法借鑒Anbu等人的方法。稱取20mg的羽毛粉，加入9.5ml的0.1mol/l的Tris-HCL緩沖

10、液（pH為7.8），最后加入0.5ml的過濾后的酶液。反應混合物在37°C孵化2 h。孵化后,含10毫升反應混合物的50毫升三角瓶浸入冰水中10分鐘,剩下的羽毛粉被過濾掉。隨后, 通過微孔膜過濾濾液收集。 然后, 在280nm處測量清晰的混合物的吸光度。角蛋白酶的酶活單位表示為一個單位對應與37°C反應 1 h相比在280 nm的吸光度值的增加0.01。數據由三個平行的平均值決定。1.7確定最佳發酵時間菌株H49-1接種于BLM培養基中，在發酵的第4，5，6，7，8天的時候分別取樣測定酶活。1.8單因素實驗幾種補償碳源(淀粉、麥芽糖、葡萄糖和甘油),氮源(NaNO3,NH4

11、NO3，NH4Cl和尿素)、硫源(Na2SO4 ，Na2SO3,Na2S2O3，bME)和二硫蘇糖醇(DTT)以及礦物鹽(MgSO4.7H2O、氯化鈣、CuSO4.5H2O ZnSO4，七水硫酸亞鐵)單獨添加(碳源20 g/l,氮源0.1%、硫源0.5mmol/l和金屬鹽0.01%)與BLM培養基中用于H49-1角蛋白酶生產。孵化六天后(培養液中孢子濃度約為1.2107每毫升,在37°C,120轉每分鐘)進行角蛋白酶活的測定。BLM作為空白對照實驗。每個實驗進行三個平行。試劑(包括淀粉)都是分析純級,并在當地購買試劑公司。1.9 Plackett-Burman設計Plackett-B

12、urman設計法是一種兩水平的實驗方法設計，它試圖用最少的試驗次數達到使因素的主效果盡可能準確的估計，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，工進一步研究。PB 法主要通過每個因子取兩水平進行分析，通過比較各個因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。對在此研究中,Plackett-Burman實驗設計的意義是用來對Soliman等人角的蛋白酶生產的方法進行一些修改。為了減小實驗誤差的值,每組值進行三個平行。sas軟件包9.1版本是用于Plackett-Burman實驗設計和分析實驗數據。1.10 Box-Behnken設計進一步優化改善角蛋白酶活。Box-Behnk

13、en設計有三個獨立變量,每個變量三個水平和中心的點的三個平行。Box-Behnken設計法，簡稱BBD，是響應面優化法常用的實驗設計方法，適用于25個因素的優化實驗。每個因素取3個水平，以（1，0，1）編碼。根據相應的實驗表進行試驗后，對數據進行二次回歸擬合，得到帶交互項和平方項的二次方程，分析各個因素的主效應和交互效應，最后在一定的水平范圍內求出最佳值。用于測定角蛋白酶活的因素符合一個多項式模型：Yb0 þ b1X1þb2X2þb3X3þb12X1X2þb13X1X3 þb23 X2 X3 þb11 X12 þb

14、22 X2 þb33 X32 Y是預測響應(角蛋白酶活動)的值,b0截距項,b1、b2和b3線性系數,b12,b13和b23是相關系數,b11、b22 b33二次系數。整個組的實驗進行了一組三個平行來求平均響應值。再根據BBD實驗得到的擬合方程，可采用繪制出響應面圖的方法獲取最優值，也可采用方程求解的方法獲得最優值。另外使用一些數據處理軟件來使結果更方便優化。但響應面分析的得到的是一個預測的結果，需要進行實驗來加以驗證。sas軟件包版本9.1被用于試驗設計和回歸分析獲得的數據。結果1 菌株GZUIFR-H49-1的鑒定研究結果表明,菌株H49-1的表型特征如下。在PDA上快速增長,

15、在35°C中生長 2.5天達到85毫米,蔓延在整個培養皿中。邊緣有毛緣,被叢卷毛或粉狀;顏色最初為白色,變成棕色,然后反向白色深棕色。菌絲光滑,0.9-1.8微米或寬3.6 -6.3微米;沒有球拍形菌絲。終端和橫向分生孢子無柄或為可變長度的短的突起或側向分支,單獨或2-3成鏈，分枝,光滑或多疣,大多數橢圓形,4.5-8.1 2.3-6.5微米，與基底測量0.52微米,孢子形成豐富。沒有居間分生孢子和厚垣孢子。H49-1嗜熱,生長最低20°C,最佳35 - 40°C和最大55°C。使用菌株H49-1的序列在基因庫中進行查詢。密切匹配顯示最大為9098%的是

16、包括嗜熱毀絲菌屬和其他相關物種。這些物種的序列都是從基因庫中檢索并進行系統發育分析。R通過DNA 的its1-5.8s-its2序列關系，來分析菌株H49 - 1和相關物種在系統發育樹上的關系 (圖2)。從系統發育樹看,它分為進化枝A和支系B。支系B中主要包含的是屬毛殼菌屬的成員。菌株H49-1不屬于支系B,這說明此菌株是相對毛殼菌屬的系統發育關系遙遠。A的進化枝中主要成員屬于棒囊殼屬。菌株H49-1是屬于(92%)這個進化枝。圖1 嗜熱毀絲真菌H49-1的孢子和菌絲a 可繁殖的菌絲和成熟的孢子；b 不同粗細的菌絲； c 孢子生成處菌絲腫脹; d 成熟的表面光滑或有疣的孢子； e 孢子連接處菌

17、絲較細2 最適發酵時間的確定在BLM培養基中, 菌株H49-1的角蛋白酶活性分別在4日,5日,6日,7日和8日時可以達到600±26.46,500±30.00,800±51.96,400±26.46和300±34.64 U / l)的水平。所以,發酵的最優結束時間是6天。圖2 發酵時間與角蛋白酶活的關系圖。3 最優碳,氮和硫源和金屬鹽離子通過增加不同的補償的碳、氮和硫的來源培養菌株H49-1后測角蛋白酶活來優化。淀粉為最佳碳源。在添加淀粉的BLM培養基中孵化后6天后，角蛋白酶活提高到1800 Ul。如圖4b c中顯示，尿素和硫代硫酸鈉，分別可以

18、最高水平的提高角蛋白酶活，與BLM的培養相比，分別可以增加200和600 Ul。但其他氮源和硫源在一定程度上抑制角蛋白酶活動。實驗得知氯化鈣是最有效的金屬鹽,角蛋白酶活可增加1600 Ul。然而,CuSO4和MgSO4會抑制角蛋白酶活動。圖3 培養基中添加不同來源的碳源（a），氮源(b),硫源(c)和金屬離子(d)對嗜熱毀絲真菌H49-1角蛋白酶活性的影響。4 篩選Plackett-Burman設計的重要因素通過使用Plackett-Burman統計設計來評估對菌株H49-1最優產角蛋白酶的影響因素。基于單因素實驗的結果和以前我們的實驗室的工作結果，八個因素被選為實驗變量(八個變量，兩個水平)

19、應用于Plackett-Burman設計，如表1中列出。使用sas軟件包對Plackett-Burman實驗的結果進行統計分析后的角蛋白酶活顯示在表1。由條件的統計分析可看出,尿素(X2)和pH值(X6)是(P < 0.05) 在這個實驗中角蛋白酶的生產的重要因素。圖4 通過對八個因素兩個水平進行PB實驗設計后對進行數據分析的結果。5 使用Box-Behnken進一步優化設計上述實驗結果的基礎上,考慮到雞羽毛作為誘導物和碳源角蛋白酶生產、雞毛、pH值和尿素被選為三個獨立變量,調查他們的互動和影響角蛋白酶的生產應用Box-Behnken設計實驗。設計矩陣和Box-Behnken設計實驗的結

20、果顯示在表2。回歸模型如下：Y 5266.667 - 25X1 - 162.5X2 - 212 .5X3 - 1058.333 X12 - 175X1 X2- 575 X1 X3 - 1783.333 X2 1633.333 X32 圖5 Box-Behnken實驗的設計和響應值；三因素的多元現行回歸分析Y是預測的角蛋白酶活(U1);X1 =(gl)是雞毛的濃度;X2 =(g1)尿素的濃度和X3 =為初始pH值。結果由角蛋白酶活的值來衡量。計算回歸結果顯示中，模型的決定系數R2值為0.9940,這表明,角蛋白酶活性變化觀察到的99.40%可以歸因于雞毛的濃度,尿素,初始pH值,這些變量之間的交

21、互影響。確定調整系數Adj.-R2 = 0.9831也是足夠高說明高擬合模型的意義。X1為30.08%,并沒有顯著的概率。X1和X2以及和X3之間的交互,顯著性概率> 95%的概率。然而,沒有發現X2和X3之間的交互作用對角蛋白酶活回歸模型的顯著性影響。上述回歸模型的擬合響應是繪制在圖5。在回歸模型中,當雞毛,尿素和的濃度和初始pH值分別為為20.10 g1.0g/1和7.9,預測的最大角蛋白酶活可達到5277.38 U1。通過采用單因素實驗，Plackett-Burman和Box-Behnken設計來優化工藝參數 ,我們可以獲得角蛋白酶活從800年5277.38 U1，約6.6倍的增加

22、。為了證明回歸模型的預測值的準確性,在最優的羽毛粉20.10g/1、尿素0.9770 g/1,初始pH值7.933和另一種金屬離子(氯化鈉5g /1,K2HPO4 6g/1和KH2PO4 1 g/1)的實驗條件下進行三個平行,在最優培養基實驗中獲得的平均角蛋白酶活性是5100 U1。實驗結果表明,潛在的最優值的角蛋白酶活動5277.38 U1基本符合實驗值5100 U1。討論微生物角蛋白酶生產會受到培養條件和培養基成分的影響,如溫度、pH值、碳和氮的來源,盡管這些因素對不同的物種有不同影響。因此,選擇和優化培養條件和培養基成分對于利用微生物生產角蛋白酶是非常重要的。通過研究碳源對嗜熱毀絲真菌H

23、49-1在角蛋白酶生產的影響表明,這些補償的碳源能夠促進角蛋白酶生產。淀粉是角蛋白酶生產最有效的補償的碳源。然而,這些影響是不適用于所有微生物。例如,培養基中補充糖(木糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇) 對生產角蛋白酶有負面影響的的真菌如短帚霉。類似的結果在地衣芽孢桿菌的研究中也有報道。這些結果表明,碳源對角蛋白酶生產的影響與所檢測真菌物種密切相關。與一些單糖或雙糖相比，淀粉可以更有效地促進角蛋白酶生產。例如,淀粉是一個可以有效增加角蛋白酶活的底物。大多數氮的來源,比如、酪蛋白、大豆,明膠,丙氨酸,NH4NO3和NH4Cl, 在生產時添加到培養基中可以抑制角蛋白酶的活性。但是，在我們的實驗中尿素是積極的氮源,這表