1、百合知母湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞的保護作用作者：許惠琴，王華富，高欽，蔡寶昌【摘要】【目的】觀察百合知母湯含藥血清對氯化鎘(cdc12)致大鼠卵巢顆粒細胞(gc)損傷的影響。【方法】 分別選用23d、3月和12月齡雌性sd大鼠各5只，取卵巢 進行gc計數，連續觀察10d內gc的生長情況，采用噻唑 藍(mtt)比色法于490nm波長處測定光密度(d)值，篩選最 適卵巢gc。(2)于最適卵巢gc體外培養的第3天加入終濃 度分別為 10、20、40、60、80umol/l 的 cdc12 刺激液， 37°c、體積分數5 %c02培養箱內培養48h后，采用mtt法 觀察細胞生長情況，篩選

2、cdc12刺激液的最適濃度。(3)將 篩選出最適的卵巢gc體外培養72h后，在96孔板內分別加 入最適濃度的cdc12刺激液及終濃度分別為體積分數1 25%、25%、5%、10%、20%的大鼠百合知母湯含藥血清，依據含藥血清濃度由低至高分為5組，同時另設對照組： 空白對照組：體積分數10%dmem培養液，模型組：體 積分數10%dmem培養液+最適濃度cd c12刺激液，空白血 清組：空白血清+最適濃度cdc12刺激液。繼續培養48h后 采用mtt比色法測定d值，觀察百合知母湯含藥血清對大 鼠卵巢gc以及對cdc12致卵巢gc損傷后的影響。【結果】 23d齡大鼠卵巢gc數量多、形態好，呈指數生

3、長，23d為最適生長時間。cdc12濃度與卵巢gc的活性呈劑量依賴性 關系，隨濃度增加而損傷加重，其中濃度為40 u mol/lc dc12培養液中的g c細胞邊緣出現皺縮，為最適cdc12刺 激液濃度。百合知母湯含藥血清對卵巢gc生長有促進作用， 能抵抗4 oumol/lcdc 12刺激液對gc的損傷作用。【結論】 百合知母湯含藥血清保護大鼠卵巢gc的作用與其能拮抗 cdc12的損傷和增加卵巢gc的活性和數量有關。【關鍵詞】百合知母湯/藥理學；圍絕經期綜合征/中藥 療法;血清藥理學;細胞培養百合知母湯出自張仲景金匱要略，是臨床治療圍絕 經期綜合征的基本方劑。目前越來越多的研究將圍絕經期 綜合

4、征與婦女卵巢功能衰退和細胞凋亡聯系起來，認為卵 巢顆粒細胞(g c)凋亡，觸發卵泡閉鎖，顆粒細胞產生雌激 素減少促進了性腺激素受體的減少從而引發本病1-2。因 此本實驗觀察了百合知母湯含藥血清對體外培養的卵巢gc 的影響，以及對氯化鎘(cdc12 )致卵巢gc損傷后的作用， 現報道如下。1材料與方法11實驗動物23d、3月和12月齡清潔級雌性sd大鼠，由揚州大學比較醫學動物中心提供，動物合格證號：sy xk (蘇)xx 00 53。12藥物及試劑百合知母湯(百合與知母質量比為3:1)，制成含生藥量為0 8g/ml的濃縮液。dmem為美國 g ibco公司產品，小牛血清(dbcs)為jrhbio

5、scie nces公司 產品。噻挫藍(mtt)由 u1 trapuregra de, amresco 分裝，臨 用前用磷酸鹽緩沖液(pbs)配制成50mg/lmtt溶液，于4°c 冰箱保存。二甲基亞砜(dms 0)為上海久億化學試劑有限公 司產品。注射用血促性素(pmsg )為寧波市三生藥業有限公 司產品(批號：0 70909)，pbs (ph=7 0)為福州邁新公司 產品(1小袋溶解在2l蒸餾水中)，cdc12由亭新化工試劑 廠生產。13儀器jaxx型電子秤為上海天平儀器廠產品，spectr amax190酶標儀為美國molecul ardevices公司產品， napcoc 02

6、incubat0 r 購自 preci si onscientif ic 公司， xsz d 2倒置生物顯微鏡為重慶光學儀器廠產品，s w cj if超凈工作臺為蘇州安泰空氣技術有限公司產品，ld z5 2型全自動離心機為北京醫用離心機廠產品，dkb8a型電熱恒溫水槽為上海精宏實驗設備有限公司產品。14卵巢g c最適生長時間和cd c12刺激液最適濃度的篩選xx年第2 6卷廣州中醫藥大學學報許惠琴，等.百合知 母湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞的保護作用1/2第6期 141卵巢gc最適生長時間取23d、3月和12月齡雌性sd大鼠各5只(其中23d齡大鼠提前48h皮下注射pmsg,66u/只），脫頸

7、椎處死后，放入盛有體積分數7 5%酒精的玻璃缸內浸泡lomino在無菌條件下，取出卵巢，剪破卵泡， 200目尼龍膜過濾，取900 u l細胞懸液，用0 4m g/l臺盼藍溶液10 opl染色，計數活細胞數（拒染）及死細胞并觀察細胞活率。將3瓶細胞密度分別調至1x106個/ml 每孔加80 ul細胞混懸液，12個復孔，共10板，放入 37°c、體積分數5%2培養箱內培養。每隔2 4h抽取1板 加 5mg/lmtt20ul，4h 后加 dms015 0 u l，振蕩 10mi n，于 490nm波長處測定光密度（d）值，連續觀察10d內不同時期 gc的生長情況，篩選出最適卵巢gc。未測板

8、每隔3d更換 50nl培養液，繼續培養、測定。2cdc12刺激液最適濃度取最適卵巢gc，將細胞密度調至ix 106個/ml后均勻接種于96孔培養板中，6 個復孔，放入37°c、體積分數5%c02培養箱內培養，第3d 時分別加入終濃度為10、20、40、60、80 u mol /l的 cdc12刺激液，空白對照組含cd c120ymol/l。繼續培養 48h后，采用mtt法觀察細胞生長情況，篩選出最適cdc12 刺激液濃度。15含藥血清的制備選取成年期雌性sd大鼠10只，隨機分為2組，每組5只。百合知母湯組每次灌胃百合知 母湯8g/kg ,每天2次，空白對照組每次灌胃等容積生理 鹽水。

9、連續給藥3d后禁食12h，于第4天一次性給予全天 劑量，lh后頸總動脈取血，離心后分離血清，56 °c水浴滅 活30min，過濾除菌。16百合知母湯含藥血清對大鼠卵巢gc的影響取最適卵巢gc，將細胞密度調至1x106個/ml后均勻接種于96 孔培養板中，6個復孔，放入37°c、體積分數5%c02培養 箱內培養，預培養72 h后，換液并加入含藥血清，依據含 藥血清濃度由低至高分為5組，使其終濃度分別為體積分 數125%、25%、5%、10%、20%o另設對照組：空白對照組：體積分數10%dmem培養液，空白血清組。繼續 培養48h后，采用mtt比色法d值，觀察含藥血清對大鼠卵

10、 巢gc的影響。17百合知母湯含藥血清對cdc12致gc損傷的影響取最適卵巢g c，將細胞密度調至1 x106個/ml后均勻接 種于96孔培養板中，6個復孔，放入3 7°c、體積分數5%c 02培養箱內培養，預培養72h后，換液并加入最適濃度的 cdc12刺激液，依據含藥血清濃度由低至高分為5組，使其 終濃度為體積分數125%、25%、5%、10%、20%。另設對照組：空白對照組：體積分數10%dmem培養液。模 型組：體積分數10%dmem培養液+最適濃度cdc 12刺激液。 空白血清組：空白血清+最適濃度cdc 12刺激液。繼續培 養48h后，采用mtt比色法測定d值，觀察含藥血

11、清對 cdc12刺激液致g c損傷的影響。18統計學方法采用微軟excel軟件進行數據的分析。2結果21卵巢gc最適生長時間的確定圖1結果顯示，23d幼年期大鼠卵巢gc數量多、形態好，在培養38d內呈指 生長，為最適的生長時間。3月齡成年期大鼠卵巢gc數量 和形態都不如幼年期大鼠的gc，且其指數生長期較短。12 月齡老年期大鼠卵巢gc數量較少，活性低，培養5 d后已 基本無細胞增殖。因此，本實驗選擇幼年期大鼠卵巢gc進 行藥物的篩選，并且選擇在培養第3天時介入干擾因素， 第4天測定細胞活性。2 2c dc12刺激液最適濃度的確定相差顯微鏡下觀到20umol/l以上濃度的cdcl 2對gc有損傷

12、作用。40 u mol/lcd c12培養的gc細胞邊緣出現皺縮，少量細胞懸浮 于培養液中。6 0、80umol/l cdc12培養的gc中多數細胞 邊緣出現皺縮，并有大量細胞脫壁死亡。表1結果顯示， 隨cdc12濃度的增加，d值降低，提示其呈劑量依賴性關系 隨濃度增加而損傷加重。因此，我們選擇40umol/lcdc12 作為最適的刺激濃度。表1不同濃度cdcl 2對顆粒細胞增 殖的影響23百合知母湯含藥血清對大鼠卵巢gc的影響表2結果顯示，空白血清組和空白對照組比較差異有顯著性意 義（p2 4百合知母湯含藥血清對cd c12刺激液導致gc損傷的影響表3結果顯示，40umol/l cdc12模

13、型組d值減小， 與空白對照組比較差異有顯著性意義(p3討論雌激素的產生需要顆粒細胞和卵泡膜細胞兩種細胞的 作用，雄激素在卵泡膜細胞內形成，由膽固醇合成孕烯醇 酮，并轉化為雄激素的中間產物無表雄酮和雄留烯二酮。 雄激素由卵泡膜細胞轉運至顆粒細胞，被芳香化酶轉化為 雌激素3。因此測定卵巢顆粒細胞的功能對研究圍絕經期 綜合征，探討藥物的作用機制具有十分重要的意義。細胞生長曲線是觀察細胞生長基本規律的重要方法之，確定生長曲線有助于了解細胞的分裂、增殖情況，只有具備自身穩定生長特性的細胞才適合觀察細胞生長變化 4,而藥物的干預也應該在細胞的指數生長期內進行，從 而使實驗結果更科學、更準確。鎘對雌性哺乳動

14、物的生殖 系統具有明顯的毒害作用，可引起卵巢病理組織學改變， 造成卵泡發育障礙，還可以抑制卵巢顆粒細胞和黃體細胞 類固醇的生物合成，影響卵巢內分泌功能5。大量體外研 究實驗表明，鎘可以通過抑制卵巢類固醇激素的生成和分 泌，使顆粒細胞功能顯著降低，從而使卵巢顆粒細胞基底 雌激素(e2)含量明顯減少6-7。刁書永等8報道，鎘對 卵巢顆粒細胞的凋亡有促進作用，并有一定的劑量相關性 本實驗結果證實，幼年期大鼠的卵巢gc活性高，指數 生長期較長，自身穩定性較好，因此，選擇幼年期大鼠卵巢gc進行藥物的篩選，并且選擇在體外培養第3天時介入 干擾因素，48h后測定細胞活性。卵巢gc在40 u mol/ lcd

15、c12培養液中邊緣出現皺縮，部分細胞懸浮死亡，與正 常生長細胞比較差異有顯著性意義(p【參考文獻】，etal. pote sofmurinegl quir ksm, porter da, hubersc ntiationof fas mediat edapoptosi ranulosace llsbyinter feron gamm a, tumornec rosisfacto r alpha, an dcyclohexi midej. en docrineolo gy, 1998, 13 9(12) : 4860 .2 張雅萍，王秀霞，劉麗.坤寧安丸對更年期大鼠卵巢 顆粒細胞凋亡及其相關基因bel 2和fas表達影響的實 驗研宄j.中國中醫藥科技，xx，8(5) :9 4.3 張紹芬.絕經_內分泌與臨床m.北京：人民衛 生出版社，xx: 10-11.4 司徒鎮強，吳軍正.細胞培養m.北京：世界圖書出 版公司，1 996: 175.5 安紅敏，鄭偉，高揚.鎘的健康危害及干預治療研宄進展j .環境與健康雜志，xx，24 (9) : 7 39cadmiumexp osureonova riansteroi dogenesisi nratsej. j appltoxico 1，1999, 19(3) : 21