1、多糖的檢測方法關于多糖含量測定，業內有兩種評價方法。一種是狹義上嚴格的多糖測定，即水提取多糖后，以凝膠色譜柱分離、洗脫提純粗多糖得到較單一分子量的多糖，再水解成各種單糖，以HPLC法分離測定各單糖，即可得到比較嚴格意義上的多糖含量及其組成。這種方法是科研級的多糖測定。另一種評價方法一般是生產企業用于質控的多糖測定：一般過程是水提醇沉粗多糖后，以葡萄糖作為相比較的物質，加入特定顯色劑后比色測定粗多糖的含量。注意，這種方法測得的是以葡萄糖作為折算的多糖含量。但這種評價方法簡單實用，能反映一定的質量指標，作為質控之用可以的了。包括中國藥典和一些國標、行標都采用此方法評價多糖含量，方法大同小異，如硫酸

2、-苯酚法，硫酸-蒽酮法。但根據不少實際檢驗人的反映，要想檢測結果有很好的重現性，還是有很多細節問題要注意的。粗多糖測定多糖的測定方法，目前有堿性酒石酸銅滴定法、比色法（蒽酮比色法、硫酸-苯酚法）。一般說來，比色法的優點是靈敏度高，樣品用量少；但缺點是一般做常規檢測時使用葡萄糖作標準品，誤差較大，應以被測物的純品作對照品，以求出換算因子，但要制備被測物的純品并非每個實驗室所能做到的，而且保健食品中往往是多種中草藥的提取物作為原料而制成，所含多糖是不同相對分子量多糖的混合體，這就給提取純品增加了難度。所以當成品中多糖含量大于1%（質量濃度）時，最好選用堿性酒石酸銅滴定。 滴定法1.樣品預

3、處理取本品適量，精密稱定，置于250ml磨口燒瓶中，精密加水50ml，稱定重量，置沸水浴回流2小時，放置至室溫，用水補足減失重量，混勻，濾過，精密吸取續濾液15ml于100ml離心管中，加無水乙醇75ml，混勻，以4000r/min離心10min，并小心棄去上清液,再加15ml熱水(溫度90)沖洗離心管中沉淀物,重復一次后再以4000r/min離心30min，棄去上清液，沉淀用乙醇液（水：乙醇=15：75）洗滌兩次，離心，棄去洗滌液。2.樣品水解將離心管中醇析物用50ml熱水（溫度90)少量多次轉移至250ml磨口三角瓶中，加入15ml濃鹽酸，開啟冷凝管，在沸水浴中回流2h，冷卻，先用40的氫

4、氧化鈉（約15ml）粗調Ph值，后用稀的氫氧化鈉溶液細調，再置于PH計上調整pH在6.87.2之間。將中和的酸解液移置至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻,過濾，濾液供滴定用。3.堿性酒石酸鉀鈉銅溶液標定3.1精密吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各5ml于150ml的錐形瓶中，加10ml蒸餾水及2粒玻璃珠，用滴定管加入9.0ml葡萄糖標準溶液于錐形瓶中。3.2將錐形瓶置電爐上迅速加熱，務必在2分鐘內至沸，并保持溶液在微沸狀態下再用標準葡萄糖溶液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至藍色剛好褪去為終點，記錄消耗葡萄糖標準溶液的總體積。同法平行操作三份，取其平均值（V1）。3.3樣品溶液預測和測定。3.3.

5、1 樣品溶液的預測精密吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各5ml于150ml的錐形瓶中，精密加入10ml蒸餾水及2粒玻璃珠，控制在2分鐘內加熱至沸，保持溶液在微沸狀態下以先快后慢的速度，從滴定管中滴加樣品水解液液進行滴定，直至溶液藍色剛好褪去為終點，記錄葡萄糖標準溶液消耗體積。3.3.2樣品溶液的測定精密吸取堿性酒石酸銅甲液與乙液各5.0ml，置于150ml錐形瓶中，精密加入蒸餾水10ml及玻璃珠2粒，從滴定管滴加比預測體積少1ml的樣品水解液，將錐形瓶置電爐上迅速加熱，務必在2分鐘內至沸，并保持溶液在微沸狀態下再用樣品水解液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至藍色剛好褪去為終點，記錄消耗葡萄糖標準溶液的總體

6、積。同法平行操作三份，得出平均消耗體積（V2）。最后計算結果乘以0.9，此為葡萄糖換算成粗多糖的細數。硫酸-苯酚比色法1、方法提要食品中相對分子質量>1×104的高分子物質在80%乙醇溶液中沉淀，與水溶液中單糖和低聚糖分離，用堿性二價銅試劑選擇性地從其他高分子物質中沉淀具有葡聚糖結構的多糖，用苯酚-硫酸反應以碳水化合物形式比色測定其含量，其顯色強度與粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此計算食品中粗多糖含量。方法原理：粗多糖在硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測定樣品在粗多糖含量。2、主要儀器（1）分光光度計；（2）離心機（300

7、0r/min）；（3）旋轉混勻器。3、試劑本方法所用試劑除特殊注明外，均為分析純；所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。（1）乙醇溶液（80%）：20mL水中加入無水乙醇80mL，混勻。（2）氫氧化鈉溶液（100g/L）：稱取100g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L，加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。（3）銅試劑儲備液：稱取3.0gCuSO45H2O，30.0g檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至1L，混勻，備用。（4）銅試劑溶液：取銅試劑儲備液50mL，加水50mL，混勻后加入固體無水硫酸鈉12.5g并使其溶解。臨用新配。（5）洗滌劑：取水50mL，加入10mL銅試劑溶液、10mL氫氧化鈉溶液，混勻。（6）硫

8、酸溶液（10%）：取100mL濃硫酸加入到800mL左右水中，混勻，冷卻后稀釋至1L。（7）苯酚溶液（50g/L）：稱取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀釋至100mL，混勻。溶液置冰箱中可保存1個月。（8）葡聚糖標準儲備液：準確稱取相對分子質量5×105已干燥至恒重的葡聚糖標準品0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含10.0mg葡聚糖。（9）葡聚糖標準使用液：吸取葡聚糖標準儲備液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1mL含葡聚糖0.10mg。4、測定步驟（1）樣品處理：a、沉淀粗多糖：準確吸取液體樣品5.0

9、mL，置于50mL離心管中，加入無水乙醇20mL，混勻5min后，以3000r/min離心5min，棄去上清液，反復操作34次。殘渣用水溶解并定容至5.0mL，混勻后，供沉淀葡聚糖。b、沉淀葡聚糖：準確吸取b項終溶液2mL置于20mL離心管中，加入100g/L氫氧化鈉溶液2.0mL銅試劑溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%（體積分數）硫酸溶液2.0mL溶液并轉移至50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣品測定液。（2）標準曲線的繪制：準確吸取葡聚糖標準使用液0、0

10、.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（相當于葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg）分別置于25mL比色管中，準確補充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻后用分光光度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡聚糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。（3）樣品測定：準確吸取樣品測定液2.0mL置于25ml比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.

11、0mL于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計在485nm波長處，以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。從標準曲線上查出葡聚糖含量，計算樣品中粗多糖含量。同時做樣品空白實驗。5、結果計算X= (m1-m2)×V1×V3×V5/m3×V2×V4×V6式中X 樣品中粗多糖含量（以葡聚糖計）（mg/g）； m1樣品測定液中葡聚糖的質量（mg）；m2 樣品空白液中葡聚糖質量（mg）； m3樣品質量（g）；V1 樣品提取液總體積（mL）； V2沉淀粗多糖所用樣品提取液體積（mL）；V3 粗多糖溶液體積（mL

12、）； V4沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積（mL）；V5 樣品測定液總體積（mL）； V6測定用樣品測定溶液體積（mL）。6、準確度與精密度在不同食品中進行不同濃度的加標回收實驗，回收率為87.8% 110.87%，不同實驗室對同一樣品進行10次測定結果的相對標準偏差為5.8%。中藥總多糖含量測定（苯酚-硫酸比色法）供試品溶液的制備：提取上清液：精密稱取樣品細粉2.2g（約相當于多糖0.22g），置燒瓶中，加水100ml置電爐上加熱回流提取1.5h，放冷至室溫，30004000rpm離心10min，收集上清液，用少量水分次洗滌燒瓶及離心管，同樣離心收集上清液。提取多糖沉淀：合并全部上清液置蒸發皿中

13、，置電爐上小心加熱（避免焦化）濃縮到約15ml，放冷至室溫，加乙醇100ml，攪勻，放置使其沉淀15分鐘。轉移此溶液連同沉淀于離心管中，繼續用少量80%乙醇以玻棒充分刮洗蒸發皿，洗液和沉淀同樣轉移至離心管中，以30004000rpm速度離心15min，棄去上清液，在離心管中加入少量80%乙醇，輕輕洗滌，同樣離心棄去上清液（保留沉淀物）。然后將離心管（連同沉淀物）于50烘箱揮干乙醇（不能見到任何液體），然后加熱水溶解沉淀，轉移至250ml量瓶中，繼續用熱水以玻棒充分刮洗離心管，洗液同樣轉移至250ml量瓶中，放冷至室溫，用水定容至刻度，搖勻，精密量取5ml置100ml量瓶中，用水定容至刻度，搖勻即得供試品溶液。標準曲線的制作：精密稱取105干燥至恒重的無水葡萄糖適量，加水配制成0.85mg/ml的貯備液。精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分別置于50ml量瓶中加水定容至刻度，搖勻得葡萄糖稀釋液。再分別精密量取上述各稀釋液2 ml置具塞試管中，同時精密量取水2.0 ml置另一具塞試管中，各管分別加5%苯酚溶液（新制）1 ml，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0ml，立即搖勻，于40水浴中保溫30min，取出，置冰水浴中5 min。以上述2.0ml水所制得的空白溶液做參比，于489nm波長處測定各溶液吸收度，以葡萄糖稀釋液的濃度（g/ml）為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標