1、3.1 植物組織培養 植物組織培養植物組織培養是指將植物組織（如花藥組織、胚乳、皮層等）給予適當的培養條件下，誘導其長成新的完整植株的一種實驗技術。 植物組織培養再生的植物“試管植物”。3.1.1 發展歷史 1902年德國植物學家哈貝爾蘭德(haberlandt)提出了器官和組織可以不斷分割直至單個細胞的觀點。并首次分離植物并進行培養，但未獲成功。被譽為“植物組織培養之父”。 1943年，美國懷特（white）正式提出植物細胞具有全能性，認為每個植物細胞具有該植物的全部遺傳信息和發育成完整植株的能力。 1934年，荷蘭植物學家溫特溫特發現了生長生長素素，即吲哚乙酸。 1948年，斯科克斯科克解

2、決了如何從離體組織和器官中誘導植物再生的問題，并確定了腺嘌呤腺嘌呤/生長素的比例是控制芽和根形生長素的比例是控制芽和根形成的一個重要條件成的一個重要條件。 1958年，施圖爾德施圖爾德從胡羅卜根韌皮部愈傷組織獲得單細胞，并誘導形成胚狀體再生了植株。這是世界上首次通過實驗證實首次通過實驗證實了植物細胞具有全能性了植物細胞具有全能性。 20世紀60年代以來，植物組織培養植物組織培養開始走向大規模的應用階段。組織培養技術被譽為農業發展史上的第四次綠色革命第四次綠色革命。 進行植物組織培養，只需要少量的材料就能獲得大量的植株，不僅可以節約大量的種子、肥料，還節約了大量的耕地，因此可以在工廠中進行育苗。

3、3.1.2 植物組織培養再生植株的途徑1、器官發生途徑2、體細胞胚發生途徑3.1.2.1 器官發生途徑 植物的離體器官發生器官發生是指培養條件下的組織或細胞團（ 愈傷組織） 分化形成不定根（adventitious roots） 、不定芽（adventitious shoots） 等器官的過程。 植物細胞脫分化是已有特定結構和功能的植物組織的細胞，在一定的條件下被誘導改變原有的發育途徑，逐步失去原有的分化狀態，轉變為具有分生能力的胚性細胞的過程。 愈傷組織：愈傷組織：脫分化后的細胞經過細胞分脫分化后的細胞經過細胞分裂產生無組織結構、無明顯極性的松散裂產生無組織結構、無明顯極性的松散的細胞團。的

4、細胞團。即即由外植體組織增生的細胞產生的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。 愈傷組織細胞是分化的，但還沒形成組織上的結構，因此愈傷組織培養過程中沒有明顯的組織或器官上的分化。 愈傷組織可以用繼代培養的方式長期保存，也可以通過懸浮培養而迅速增殖用作無性系；也可以用作原生質體培養時原生質體的來源。 外植體：外植體：植物體上切取下來進行培養的部分組織或器官。即植物組織培養中用來進行離體無菌培養的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質體等。 繼代培養：繼代培養：是指愈傷組織在培養基上生長一段時間后，營養物枯竭，水分散失，并已經積累了一些代謝產物，此時需要將這些組織轉移到新的培養基上，這種轉移稱為繼代培

5、養或傳代培養。離體培養條件下， 經過愈傷組織再分化器官一般要經過四個生長階段。（一）啟動期：誘導外植體細胞脫分化和分裂。（二）外植體經過誘導形成愈傷組織形成愈傷組織。（三）擬分生組織 的形成。當把愈傷組織轉移到有利于有序生長的條件下以后， 首先在若干部位成叢出現類似形成層的細胞群， 通常稱之為“生長中心”， 也稱為擬分生組織，它們是愈傷組織中形成器官的部位。（四）器官原基及器官形成器官原基及器官形成。通過器官發生形成再生植株大體上有三種方式： 第一種方式是先芽后根先芽后根: 第二種方式為先根后芽先根后芽: 第三種方式是同時生根發芽同時生根發芽:在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯

6、系形成完整植株。 在有些情況下， 外植體不經過典型的愈傷組織即可形成器官原基。這一途徑有兩種情況： 一是外植體中已存在器官原基， 進一步培養即形成相應的組織器官進而再生植株， 如莖尖、根尖分生組織培養； 另一種情況是外植體某些部位的細胞， 在重新分裂后直接形成分生細胞團，然后由分生細胞團形成器官原基。這種不經過愈傷組織直接發生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養中具有重要的實踐意義。 研究表明， 在葉肉細胞再生植株過程中，最初分裂細胞的第一次分裂軸向是十分重要的。在不經過愈傷組織的器官分化中，這次平周分裂既是葉肉細胞的脫分化，同時也是該細胞轉變發育方式極性的確定。現在，有人把最先啟動分裂的這

7、些細胞稱之為感受態細胞。植物組織培養的基本步驟 （一）培養材料的采集 （二）培養材料的消毒 （三）制備外植體 （四）接種和培養 （五）根的誘導 （六）練苗（一）培養材料的采集1、受精卵2、發育中的分生組織：根尖、嫩莖、幼葉、花3、雌雄配子、單倍體細胞 其中莖尖最常用。（二）培養材料的消毒1、自來水沖洗 蒸餾水沖洗 無菌紗布或吸水紙吸干水分 消毒刀片切成小塊。2、70%酒精浸泡消毒30-60s。3、漂白粉飽和液或0.01%升汞水中消毒10min。4、無菌水沖洗3-4次。（三）制備外植體 在無菌環境下，將已消毒的材料用無菌刀、剪、鑷等，剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮或種皮胚乳（葉片不需剝皮）。然后切成0

8、.2-0.5cm厚的小片。 操作中嚴禁用手接觸材料。（四）接種和培養1、接種：無菌環境下，將切好的外植體立即接種在培養基上，每瓶接種4-10個。2、封口：接種后，瓶、管用無菌棉或蓋封口，培養皿無菌膠帶封口。3、溫度：25左右。4、增殖：在新梢形成后需繼代培養。把材料分株或切段轉入增殖培養基中。蝴蝶蘭試管苗工廠化生產蝴蝶蘭試管苗工廠化生產（五）根的誘導 繼代培養形成的不定芽和側芽一般沒有根，必須轉入生根培養基中進行生根培養。1月后可獲健壯根系。（六）練苗 先將培養容器打開，于室內自然光照3天，后取出小苗，自來水沖洗掉根系上培養基，栽入消毒后的基質中。 移栽前注意遮蔭，水分管理，保持較高空氣濕度。

9、 3.1.2.2 體細胞胚發生途徑 離體培養下沒有經過受精過程，但經過了胚胎發育過程所形成的胚的類似物（不管培養的細胞是體細胞還是生殖細胞），統稱為體細胞胚或胚狀體。 這一定義有以下幾方面的界定： 其一，體細胞胚是離體培養的產物，只限于在離體培養范圍使用， 以區別于無融合生殖胚； 其二，體細胞胚起源于非合子細胞，以區別于合子胚； 其三，體細胞經過了胚胎發育過程，以區別于離體培養中器官發生形成個體的途徑。（一）體細胞胚的形成途徑1體細胞胚從外植體上直接發生 莖表皮、葉、子葉、下胚軸等外植體分化細胞經過脫分化后均可以產生胚狀體。如：在以葉片為外植體的培養中， 體細胞胚的直接形成可分為兩個階段： 1

10、）誘導期。在此階段中，葉片表皮細胞或亞表皮細胞感受培養刺激， 進入分裂狀態。2）是胚胎發育期。在這一階段， 形成的瘤狀物繼續發育， 經過球形胚、心形胚等發育過程，最后形成體細胞胚。2懸浮培養細胞的體細胞胚胎發生 在胡蘿卜細胞懸浮培養中， 體細胞胚胎形成的細胞學觀察表明， 其培養物中存在兩種類型的細胞：一是自由分散在培養基中的大而高度液泡化的細胞，這類細胞一般不具備胚胎發生潛力； 二是成簇成團的體積小而細胞質致密的細胞，這類細胞具有成胚能力， 因而，把這類細胞團又稱為胚性細胞團。 胚性細胞團轉移到適宜的胚胎發生培養基上以后， 其外圍的許多細胞開始第一次不均等分裂，靠近細胞團方向的一個細胞較大，

11、以后發育成類似胚柄的結構。另一個細胞則繼續分裂形成類似原胚的結構， 以后經過類似于體內的發育過程，經球形期、心形期等發育階段形成完整的體細胞胚。 通過懸浮細胞系再生體細胞胚，由于胚性細胞可以繼代增殖，因此可以提高胚胎的生產效率。3經過愈傷組織的體細胞胚發生 經過愈傷組織的胚胎發生需要三個培養階段： 第一階段是誘導外植體形成愈傷組織； 第二階段是誘導愈傷組織胚性化； 第三階段是體細胞胚形成。 在以幼胚、胚以及子葉為外植體時，通常可以直接誘導胚性愈傷組織產生， 進而發生體細胞胚。因此， 經過愈傷組織的體細胞胚胎發生，胚性愈傷組織的形成是培養的關鍵。進而發生原胚，經過不同時期完成體細胞胚胎發育 4、

12、單細胞發生途徑主要指小孢子或大孢子細胞培養產生胚狀體。5、原生質體發生途徑原生質體是去掉細胞壁后裸露的球形細胞。培養植物原生質體，再生細胞壁后，經過分裂產生的細胞團也可以形成胚狀體。3.1.3 植物組織培養的培養基1）無機鹽：大量元素（氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂）、微量元素（鐵、錳、銅、鋅、氯、硼、鉬）。一般只含無機鹽的培養基叫基本培養基，只有很少幾種植物組織能夠培養和維持下去。2）有機物：糖類、氨基酸、維生素、醇類。3）調節物：生長素、細胞分裂素、赤霉素 注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復雜的天然產物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。 植物激素：自然狀態下產生的、對生長發育有顯著作用的

13、微量有機物。 包括：生長素、細胞分裂素、赤霉素、乙烯等。 生長素：促進細胞分裂、誘導根的分化。常用的有吲哚乙酸（iaa）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-d）、萘乙酸（naa）、吲哚丁酸（iba) 細胞分裂素：促進細胞分裂、誘導芽的形成。常用的有6-芐氨基嘌呤（ba）、6-呋喃氨基嘌呤（又稱激動素，kt）常用培養基（1）富鹽平衡培養基：ms、ls、bl、bm、er（2）高硝態氮培養基：b5、n6、sh（3）中鹽培養基：nitsch、miller、h（4）低鹽培養基：white、ws、he、hb3.1.4 植物組織培養問題分析（一）起始材料對器官分化的影響1母體植株的遺傳基礎2外植體的類型：外植體

14、對誘導反應及其再生能力的影響體現在外植體的生理狀態上。總體來講，生理狀態年輕，來源于生長活躍或生長潛力大的組織和器官的細胞更有利于培養，但具體到不同的植物類型則有較大差異。 外植體選取合理與否，不僅影響培養的難易，而且有時甚至影響分化的程度和器官類型。1974 年tran thanh van 等取煙草正在開花的植株的薄層表皮進行培養，結果不同部位的表皮外植體所形成的芽的類型不同。（二）激素對器官分化的調控 激素在細胞生長與個體發育中具有重要的調控作用。離體培養下的器官分化，在大多數情況下是通過外源提供適宜的植物激素而實現的。在眾多的植物激素中， 生長素與細胞分裂素是兩類主要的植物激素， 在離體

15、器官分化調控中占有主導地位。 離體培養中， 外源激素在細胞內的吸收和代謝影響到激素的活性從而影響其培養效果。（三）光照對器官分化的影響 光照時間、強度以及光質對器官分化均有影響。 由于培養條件下光合作用能力較低，因此光照的作用更大程度上是調節細胞的分化狀態，而不是合成光合產物。 光照對器官發生的調節可能與其對培養物內源激素平衡的調節有關。3.2 植物胚胎培養 植物胚胎培養：指對植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）進行人工離體無菌培養，使其發育成幼苗的技術。1、成熟胚培養：指子葉期至發育成熟的胚的培養。2、幼胚培養：指早期原胚、球性期胚、心形期胚、魚雷期胚的培養。3、胚乳培養：指處于細胞期的胚乳組織

16、的離體培養。4、胚珠和子房培養：胚珠培養指未受精或受精后的胚珠的離體培養。子房培養指授粉和未授粉的子房的離體培養。3.3 毛狀根培養 毛狀根：又名發狀根，是植株或組織、器官受到發根農桿菌感染后而形成的類似頭發一樣的根組織。 發根農桿菌中有個ri質粒， ri質粒具有兩個功能區，其中t-dna區上有生長素合成基因，生長素可以誘導根的形成。三種毛狀根培養方法1、外植體接種法：取植物的葉片、莖段、葉柄等無菌外植體，與發根農桿菌共培養2-3天，將植物的外植體移到含有抗生素的選擇培養基上進行培養，經過多次繼代培養可產生毛狀根。2、莖桿接種法：將植物種子消毒后，在合適的培養基上萌發，長出無菌苗。取莖尖繼續培養，等無菌植株生長到一定時候，將植株的莖尖、葉片切去，剩下莖桿和根部，在莖桿上劃出傷口，將帶ri質粒的發根農桿菌接種在傷口處和莖的頂部切口處，經過一段時間培養，在接種部位產生毛狀根。3、原生質體-農桿菌共培養法：將原生質體培養3-5天后，加入發根農桿菌進行共培養，然后