1、色素上皮衍生因子（ PEDF ）在膀胱癌中的表 達及其對膀胱癌治療作用的研究一、趨勢判斷和需求分析國內外現狀、 水平和發展趨勢 （含知識產權狀況和技術標準狀況） ；經濟建 設和社會發展需求；科學技術價值、特色和創新點。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病， 全世界范圍內統計其發病率占全身腫瘤的第 8 位，在男性其標 準發病率 9.9/10 萬；在女性，其標準發病率為 2.3/10 萬，占第 25 位。死亡率在男性為 4.2/10 萬，占全身 腫瘤死亡率的第 9 位，在女性為 1.1/10 萬，占第 16 位。在我國 ,膀胱癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤， 占全身惡性腫瘤的 3.2% ，1995年，北

2、京市城區膀胱癌發病率大約為 7/10 萬人，上海市城區發病率為 8.6/10 萬人1 ，且今后發病率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤，膀胱癌發病機制和治療方面 的研究始終是臨床基礎研究的重點之一。目前膀胱癌的治療仍以手術切除為主，輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治 療等措施 , 但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復發，復發率高達80%，其中大約 16%-25%復發的腫瘤其惡性程度增加，有 10%發展為浸潤性或轉移性癌，因此 ,尋找一種新的、更有效的生物治療 方法，是當前臨床迫切需要解決的問題。在膀胱癌的這些輔助性治療方法中， 無論是化療還是免疫治療， 主要機

3、制是通過直接殺死腫瘤細胞、 阻斷腫瘤細胞分裂或誘導細胞調亡的方式來抑制腫瘤生長。做為一種實體性腫瘤生長，腫瘤細胞的增殖 固然重要，而新生血管的形成在腫瘤的生長和復發、轉移過程中也發揮非常重要作用。在正常狀態下， 人體內的脈管系統在血管生長因子和抑制因子網絡式的相互作用下處于平衡狀態；病理狀態下，尤其是 發生惡性腫瘤時，這種平衡向血管生成的方向發展。當腫瘤生長達到腫瘤組織超過 2mm 時就會有新生血 管形成，如果沒有新生血管生成，腫瘤生長明顯受到抑制，甚至停止 2，3。抗血管生成療法是不同于目 前常規療法的新的腫瘤治療策略，具有高效低毒和不易產生耐藥性的特點4 。有關血管生長因子和血管生長抑制因

4、子在腫瘤中所起作用，以及通過抗血管生成治療腫瘤已經成為當前腫瘤研究的一個熱點。近來研究發現，色素上皮衍生因子（ pigment epithelium derived factor, PEDF ）是一種對腫瘤有抑制 作用的細胞因子。這種細胞因子是 Tombran-Tink 等在實驗中發現的，由人視網膜色素上皮細胞分泌的一 種蛋白質，分子量為50 KD5，屬于serpin卵白蛋白/PAT-2亞群，其基因全長16 kb，位于染色體17p13.1-pter6多項研究表明， PEDF 是一種天然的高效的新生血管抑制劑7 ，并通過誘導腫瘤細胞分化起到抑制腫瘤生長的作用。Tombran-Tink等將PEDF

5、基因定位于染色體17p13.1,腫瘤發生與該區域關系密切，提示該基因可能是抑癌基因或腫瘤相關基因 5 。對腫瘤細胞進行編碼 PEDF 的腺病毒轉染，在血管內皮 生長因子( Vascular endothelial growth factor ， VEGF )存在的情況下， PEDF 明顯阻止了血管內皮細胞管 腔形成和遷移。對患有 CNV/AMD 患者的體外實驗也發現， PEDF 大量減少的情況下，內皮細胞有明顯 遷移；而對照組含有正常水平 PEDF,則抑制了內皮細胞的遷移 6。Crawford等發現PEDF在神經母細胞瘤 中是腫瘤細胞分化調控的主要的抗血管生成的抑制劑 7 。肝癌患者血管增生和

6、腫瘤發展中， PEDF 作為 VEGF 的拮抗因子， 起到了抑制作用。 對裸小鼠的在體實驗以及鼠的肺癌模型也同樣證明了 PEDF 對腫瘤 的抑制作用。其機制乃因 PEDF 減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成，從而抑 制腫瘤的生長，在腫瘤的治療前景上非常樂觀 8。我們最近對 PEDF 在膀胱癌中表達情況的初步研究發現， PEDF 在膀胱癌組織中表達明顯低于正常 膀胱組織，而且 PEDF 表達情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負相關，提示PEDF 在膀胱癌的發生、發展中具有一定的作用， PEDF 的正常表達可能抑制膀胱癌細胞的生長、增殖， PEDF 有 可能成為膀胱

7、癌生物學治療的一種有效的新方法。目前國內、外尚未見此項研究的相關報道。因此我們 設想，擴大樣本量，應用分子生物學技術檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織中PEDF 的表達水平，進一步研究 PEDF 在膀胱癌中的表達情況，并結合臨床資料分析 PEDF 表達與膀胱癌分期、分級、轉移及預后 的關系；通過研究膀胱癌組織中 PEDF 與 VEGF 表達的相關性， PEDF 與血小板反應素 -1 表達的相關性， 探討膀癌組織中 PEDF 表達與腫瘤血管形成的相關性及可能的作用機制；通過研究PEDF 表達與金屬蛋白酶-9( MMP-9 )的相關性，探討 PEDF表達與膀胱癌浸潤的相關性；通過研究PEDF表達與已知的

8、對腫瘤生長有明確調節作用的腫瘤壞死因子a( TNF- a)、白細胞介素 1 a ( IL-1 a)、血栓調節蛋白(thrombomodulin )和白介素8 (IL-8 )等細胞因子表達的相關性，探討PEDF表達對膀癌細胞調節的可能機制，從而探討 PEDF 在膀胱癌發生、發展過程中的可能作用機制；在此基礎上，以連接有PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株、以 PEDF 蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，進一步探討 PEDF 表達對 膀胱癌細胞生長的抑制作用以及對膀胱癌的治療效果,為膀胱癌的生物學治療探索一種有效的新方法。2004.5：898-917參考文獻2 吳階平， 吳階平泌尿外科學，山東科學

9、技術出版社，二、研究內容和技術關鍵研究的總體目標 ：(1) 研究 PEDF 表達與膀胱癌的發生、分期、分級、轉移及預后的關系，探討 PEDF 表達在膀胱癌 發生、發展及轉移過程中可能的作用機制。(2) 研究 PEDF 對膀胱癌細胞的治療效果，為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法 研究的創新點：本課題研究的內容和思路不同于以往的其他研究，應用分子生物學方法從研究 PEDF 表達與膀胱癌的發 生、分期、分級、轉移及預后的關系入手，探討 PEDF 表達在膀胱癌發生、發展和轉移中可能的作用機 制。在此基礎上，以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株、以 PEDF 蛋白治療裸鼠

10、膀 胱癌模型，探討 PEDF 對膀胱癌的治療作用。目前，本項研究國內、外尚未見報道。本研究的順利完成， 將為膀胱癌的生物學行為的研究開辟了新的途徑，也將為膀胱癌的生物學治療探索一種新的有效方法。研究的主要內容：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF 和相關細胞因子表達的檢測及相關性研究： 應用分子生物學技術研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF 表達狀況，并檢測 VEGF 、TSP-1、MMP-9、TNF-a、IL-1 a、血栓調節蛋白(thrombomodulin )和IL-8的表達狀況；采用免疫組化技術檢 測膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度(microvascular den

11、sity，MVD)，分析PEDF與VEGF、TSP-1、MMP-9 、 TNF-a 、 IL-1 a 、血栓調節蛋白和 IL-8 表達的相關性， PEDF 與 MVD 的相關性；并結合臨床 資料分析研究 PEDF 表達與膀胱癌患者 5 年生存率之間的關系；闡明 PEDF 表達與膀胱癌的發生、分期、 分級、轉移及預后的關系，探討 PEDF 表達在膀胱癌發生、發展中的可能機制。(2) PEDF 對膀胱癌細胞株的治療：以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株,以空載轉染膀胱癌細胞株作為對照，觀察檢測 VEGF 、 TNF-a 的表達情況及膀胱癌細胞的凋亡、增殖情況。(3) PEDF

12、對裸鼠膀胱癌模型的治療： 以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以 PEDF 蛋白(購自吉泰生物科技有限公司) 直接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內作為治療組， 以未注射 PEDF 組為陰性對照組。 觀察各組的 MVD 、 VEGF 及腫瘤增殖情況，探討 PEDF 表達在膀胱癌發生、發展中的作用機制，評估 PEDF 對膀胱癌的治 療效果，為進一步過度到臨床應用提供依據。需要解決的技術關鍵:(1) 連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株的轉染成功率。(2) PEDF定量檢測：我們已有對前列腺癌、腎癌、膀胱癌等組織標本的PEDF定量分析的基礎,形成較成熟技術條件、設備和研究經驗。(

13、3) 膀胱癌裸鼠模型的構建。我們已有成功構建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的經驗。研究方法：方法(1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關細胞因子表達的檢測及相關性研究：實驗組對照組膀胱癌組織非癌膀胱組織標本A期B期C期D期癌旁膀胱組織正常膀胱組織炎性膀胱組織例數30303030120120120PEDF .應用SYBRGreen I實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR技術,對膀胱癌、非癌膀胱組織中進行定量測定。 .Western blot 法檢測 VEGF TSP-1、MMP-9 .ELISA法檢測TNF- a、IL-1 a、血栓調節蛋白、IL-8濃度。 .免疫組化方法檢測標本 M

14、VD .整理臨床資料：膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級、是否轉移、5年生存率。 .數據統計分析(使用SPSS統計分析軟件)：PEDF與 VEGF表達的相關性。PEDF與 TSP-1表達的相關性PEDF與 MMP-9表達的相關性PEDF與 TNF- a、IL-1 a、血栓調節蛋白、IL-8濃度的相關性。PEDF與組織MVD相關性。PEDF與膀胱癌分期的相關性。PEDF與膀胱癌惡性程度（分級）的相關性。PEDF與膀胱癌轉移的相關性。PEDF與膀胱癌5年生存率的相關性。方法（2） PEDFX寸膀胱癌細胞株的治療：以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞，以空載轉染膀胱癌細胞作為對

15、照，檢測VEGFTNF-a濃度，觀察細胞的增殖、凋亡情況，分析相關性。 . 以RT- PCR法擴增PEDF基因。 .將擴增后的PEDF基因連接入腺病毒載體，轉染膀胱癌細胞。并以空載轉染為對照。 . Western blot 法檢測 VEGF、TSP-1、MMP-9表達。 . 觀察膀胱癌細胞增殖、侵襲、凋亡情況。 . 統計分析。方法（3） PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內作為治療組，以未注射 PEDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌組織 MVD VEGF表達情況、腫瘤增殖情況，評 價PEDF對膀胱癌的治療效果。

16、. 以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下構建膀胱癌裸鼠模型。 .將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內。 .應用免疫組化方法檢測 MVD應用 Western blot 法檢測VEGF TSP-1、MMP-9觀察腫瘤增殖、凋亡情況。分析PEDF與 VEGF的相互作用關系及其對腫瘤生長的作用機制。技術路線：膀胱癌標本癌旁膀胱組織標正常膀胱組織標炎性膀胱組織標RT-PCR 檢測 PEDFmRNIA表達Western blot法檢測VEGFELISA法檢測TNF-a、 IL1 a、血栓調免疫組化方法檢測標本微血管密度結合臨床資料，數據統計分析(2) PEDF對膀胱癌細胞株的治療:將PEDF轉染膀胱癌細胞株，檢測 VE

17、GF TSP-1、MMP-9 TNF- a濃度，觀察腫瘤細胞的增殖、凋亡RT PCR法擴增PEDF基因連接入腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株情況。結果分析PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療:管密度MMP-9定量測殖、侵襲情況觀察PEDF與 VEGF ME 細胞的抑制作用結果分析先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎研究（包括分子生物學研究）和臨床研究，如：裸鼠膀胱癌模型的建立、 CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表達與膀胱癌的關系、 VEGF表達與膀胱 癌的關系等，熟練掌握了泌尿生殖系統腫瘤分子生物學和細胞學研究的技術方法，如RT-PCR、southern、northern雜交、DNA測序、擁

18、有獨立的泌尿外科免疫、病理、分子生物學和細胞學實驗室，實驗室設備完善，技術方法先進，擁有 PCR-擴增儀、酶標儀、各種電泳槽、凝膠成像設備、細胞房及各種基礎實驗M N1 N2 N3 T1 T2 T3累了較豐富的研究經500最近我們開1OO癌組織中 PDEF表達的初步研究，掌握了對腫瘤組織包括膀胱設備等,為本課題的順利進行提供了有力的技術和儀器設備保證。細胞培養、腺病毒載體構建等技術 積更利條件。例如：已完成對膀胱腫瘤與正常膀胱組織PEDF（1）定量PC表達明顯降低（見|N1，N2，N3 :正常膀胱組織:T1，T2，T3 :膀胱癌組織GAPDH :內參照在正常膀胱組織中高表達,而在膀胱癌組織中M:為標記分子量GAPDH圖1 :正常膀胱組織與膀胱癌組織 PEDF定量PCR（2）在膀胱癌組織中 PEDF低表達與微血管增殖相關（見圖 2）。 預期成果：（1）明確測定出PEDF在膀胱癌中的表達情況以及其與相關細胞因子表達之間的關系。（2）PEDF在膀胱癌發生、發展過程中起重要作用。（3）PEDF對膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨床應用提供強有力的實驗依據。成果以論文的形式表達，并申請“ PEDF治療裸鼠膀胱癌模型技術”的專利；擬發表論著5-7篇,其中國內權威雜志 4 5篇，SCI收錄雜志2篇。申請成果鑒定。本課題實施過程中，形成一整套的細胞因子檢測方法、膀胱癌細胞株培養