1、HSP27在糖尿病膀胱功能障礙中的作用及機制研究研究背景: 糖尿病膀胱功能障礙 (Diabetic Bladder Dysfunction,DBD) 是糖尿病(Diabetes MellitusQM)的一個常見并發癥。又稱糖尿病性膀胱病(Diabetic cystopathy,DCP), 發生機制目前認為與高血糖導致的膀胱逼尿肌功 能障礙和外周自主神經病變相關 , 且肌源性和神經源性兩大因素協同發揮作用 , 最終通過膀胱興奮性、順應性、收縮性的改變導致DM膀胱功能受損。膀胱逼尿肌細胞的變化直接表達上述損傷改變。DM膀胱逼尿肌超微結構的改變,細胞相關收縮蛋白的結構受損是膀胱逼尿肌收縮功能障礙最主

2、要的結構基 礎。因此如何有效保護逼尿肌結構、 促進其恢復具有重要的臨床意義。 新研究提 示熱休克蛋白 27(heat shock protein27,HSP27) 起穩定細胞骨架結構的作用 , 同 時發揮了重要的調節平滑肌收縮的作用。鈣介質素(Caldesmon,Ca D)是一種細肌絲收縮相關蛋白,在調節平滑肌收縮 中起著非常重要的作用,而在DM表達增高。新近研究說明,HSP27的磷酸化能競 爭性抑制 Ca D 與原肌球蛋白 (Tropomyosin,TM) 的結合影響結腸平滑肌的收縮。我們課題組前期實驗結果說明 HSP27在 DBD大鼠膀胱中表達下降,提示HSP27與 Ca D的相互作用可能

3、與DBD中膀胱收縮功能障礙發生有密切聯系。如 果這一過程參與了 DBD膀胱收縮功能障礙的發病，那么調節HSP27的表達或磷酸 化水平,增加HSP27對Ca D調節作用,是否能對膀胱收縮功能有保護作用,其具體 機制是什么是本課題希望解決的問題。本課題對逼尿肌細胞中HSP27及 Ca D的研究有助于深入理解DBD勺發生機制、探索逼尿肌收縮功能障礙的保護措施和治療靶點并為預后評估提供新的依據。DBD發病率高，臨床療效差。DBD是 DM的一個常見并發癥,占DM患者的40%-100%即使在血糖控制穩定 的患者中,仍有25%勺DBD發病率。DBD起病隱匿,進展無病癥,易被醫患雙方無視,最終出現包括慢性尿潴

4、留, 充盈性尿失禁 , 伴不可逆性或繼發性尿路感染 , 反流性腎積水 , 腎功能損害等在內 的由于膀胱收縮功能障礙所引起的嚴重影響生活質量的并發癥。DBD膀胱在超微結構常以逼尿肌的退化性改變為主要特征。肌絲滑行理論解釋了肌收縮原理。 不同于骨骼肌 , 因為沒有肌鈣蛋白 , 平滑肌 的收縮需要更多的依賴類似于肌鈣蛋白作用的細肌絲收縮相關蛋白來介導 , 從而 實現在缺乏肌鈣蛋白和胞質 Ca2+變化的情況下，經由這些細肌絲收縮相關蛋白 介導以及這種介導上游的某種調控機制來共同完成平滑肌的收縮。DM中膀胱逼尿肌(detrusor smooth muscle,DSM) 的功能發生改變,這種改變 與其收縮

5、相關蛋白及上游調控機制的關系尚不清楚。HSP27作為一種重要的分子 伴侶,平滑肌組織在應激狀態下HSP27的表達和活化狀態可代償性增加并有助于 維持和重建肌細胞的收縮功能。磷酸化后HSP27產生功能活性。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是 HSP27 磷酸化的上游信號通路。p-HSP27Ser15p-HSP27Ser78 和 p-HSP27Ser82 是熱休克蛋白 27的 p38 MAPK 途徑可激活的磷酸化位點,Ser15位于N,Ser78、Ser82位于C端。磷酸化的HSP27 可通過抑制絲狀肌動蛋白 (F-Actin) 的解聚和促進球狀肌動蛋白 (G-Actin)

6、的聚 合發揮穩定平滑肌細胞骨架和增強細胞收縮力的功能，但是HSP27對肌動蛋白的聚合和穩定作用機制目前尚不完全清楚HSP27在糖尿病膀胱平滑肌收縮功能中的作用亦尚未見報道。Ca D及TM為代表的細肌絲收縮相關蛋白 ,在調節平滑肌收縮中起著非常重要的作用。Ca D大小為-87KD,是一種細肌絲相關蛋白,能與Act in和TM結合，此時TM 位于 Actin 單體的外緣 , 封閉了 Actin 上的 myosin 的結合位點 , 阻礙 myosin 的頭 部與Act in的結合,從而調節平滑肌的收縮。近期研究說明，在兔DBD模型中，膀 胱逼尿肌的Ca D TM等種細肌絲收縮相關蛋白的表達增高,膀胱

7、逼尿肌的收縮力 降低, 但其具體的調節機制不清楚。磷酸化HSP27可與Ca D結合，導致Ca D與TM的解離，從而暴露出Act in上 的 mysoin 的頭部結合位點 ,myosin 與 Actin 的結合, 調節結腸平滑肌的收縮。 這 一作用及機制尚未在DBD中報道。我們前期實驗結果說明在 DBD大鼠逼尿肌中HSP27勺表達下降,既往研究還 發現在兔的DBD模型膀胱逼尿肌細胞中Ca D、TM等細肌絲相關收縮蛋白表達升 高,但DM狀態膀胱逼尿肌收縮的調節機制不清楚。我們推測 :DBD逼尿肌細胞結 構功能受損,Ca D等相關收縮蛋白表達增多，但HSP27表達下降,HSP27與Ca D 結合減少

8、,故而Ca D與TM的結合增多,TM圭寸閉Actin上的mysoin的頭部結合位 點, 從而致膀胱逼尿肌處于舒張狀態 , 逼尿肌收縮無力。本研究的主要策略：本工程擬選ZDF大鼠作為DM大鼠模型,并利用HSP27特 異性磷酸化抗體,檢測DBD逼尿肌HSP27表達及磷酸化水平的改變；以及調節 HSP27磷酸化后離體逼尿肌條收縮相關功能的變化,初步驗證HSP27寸DBD后逼 尿肌收縮功能的影響；為了明確HSP27勺表達及磷酸化與CaD TM等相關收縮蛋 白之間的相互作用在DBD的關系,我們通過調節體外培養逼尿肌細胞中 HSP27勺磷酸化水平改變基因轉染后檢測HSP27與 CaD TM的共表達變化；激

9、光共聚焦 檢測磷酸化HSP27與Ca D等收縮相關蛋白的相互定位關系,探討其在穩定肌動蛋白結構、調節平滑肌收縮中的作用機制。研究一調節HSP27磷酸化改變糖尿病大 鼠的膀胱收縮功能的研究目的 : 研究正常大鼠與 ZDF(zucker diabetic fatty) 糖 尿病大鼠膀胱收縮功能的差異 , 超微結構差異。方法：將2月齡ZDF雄性大鼠DM組(n=20)高糖高脂飼養，將2月齡SD雄性大 鼠對照組 (n=20) 正常飲食條件下飼養 ,16 周后檢測大鼠的空腹血糖 , 行尿動力學 檢測(膀胱剩余尿量、最大膀胱容量、最大膀胱壓力);透射電鏡檢測DMfi與對照 組膀胱逼尿肌組織超微結構改變情況；

10、用HSP27磷酸化p38MAP途徑的特異性抑 制劑和沖動劑 SB203580(C21H16FN3O和 Anisomysin(ab120495 C14H19NO預處 理肌條,分別檢測HSP27去磷酸化或過磷酸化對肌條收縮力和收縮頻率的影響。 結果:DM組膀胱收縮功能和逼尿肌牽張力低于 SD組大鼠,糖尿病大鼠膀胱逼尿肌 超微結構發生明顯退行性變化。DM組牽張力顯著低于SD組;HSP27磷酸化途徑特異性的抑制劑SB203580刺 激肌條后DM組及SD組肌條牽張力降低;HSP27磷酸化途徑特異性的沖動劑 Anisomysin刺激后DM組及SD組肌條收縮力升高。SD組抑制后牽張力與未經處 理DM組無顯著

11、差異；DM組抑制后與未經處理DM組無顯著差異；DM組沖動后牽張 力與未經處理SD組無顯著差異。結論:1.DBD膀胱收縮力顯著降低ZDF糖尿病雄性大鼠是理想的2型糖尿病 研究動物模型 , 血糖明顯高于正常大鼠 , 膀胱逼尿肌最大排尿壓力顯著低于正常 大鼠。2.DBD膀胱結構退化用電子顯微鏡檢測逼尿肌超微結構與對照相比，糖尿 病組ZDF大鼠的逼尿肌細胞肥厚、腫脹，細胞內肌絲減少和萎縮。3.DBD的逼尿肌牽張力明顯低于正常組,趨勢與膀胱排尿壓一致。4.DBD中HSP27磷酸化起重要的調節作用：針對正常組,下調其HSP27勺磷酸化水平,牽張力可降低到與糖尿病組相近；針對糖尿病組,上調其HSP27勺磷酸

12、化水平,牽張力 可接近正常組；而下調其HSP27勺磷酸化水平,牽張力無更明顯降低。研究二高糖對大鼠逼尿肌組織及細胞的HSP27及磷酸化水平Ca D、TM的表達影響及機制研究目的：研究糖尿病膀胱組織HSP27及其磷酸化位點Ser15、 Ser78、Ser82以及CaDTM的表達差異；不同濃度葡萄糖是否對逼尿肌細胞 HSP27 及磷酸化水平表達和相關收縮蛋白 Ca DTM的表達有影響;3 D-HSP27和3G-HSP27 經慢病毒轉染逼尿肌細胞后是否對 HSP27及相關收縮蛋白Ca D、TM的表達有影 響。方法：利用免疫熒光染色,組織學檢測DM組與對照組膀胱HSP27和Ca D TM 的表達與分布

13、情況；用QRT-PC和Western-blot的方法檢測DM膀胱及對照組膀 胱中HSP27的轉錄和表達水平差異。利用特異性的磷酸化抗體標記檢測 HSP27 Ser15 Ser78和Ser82的磷酸化 水平變化。用QRT-PCR口 Western-blot的方法檢測DM膀胱及對照組膀胱中CaD TM等相關收縮蛋白的轉錄和表達水平差異。SD大鼠斷頸處死，超凈工作臺內開腹，取出膀胱,去黏膜層并剪碎后移入10ml 0.1%膠原酶P消化液的離心管中，37 C孵育45min到1h,漂洗后細胞懸液重 懸于含10%FBS勺DME培養基中 ； 培養基 中正常葡萄糖濃度(5m M)為對照組，高葡 萄糖濃度(50m

14、 M)為干預組，通過免疫熒光染色和 westernblot檢測48h后HSP27 在逼尿肌細胞表達和磷酸化水平，通過QRT-PC和 Western-blot的方法檢測逼尿 肌細胞中Ca D TM的轉錄和表達水平差異。構建、純化 LV5-3G-HSP27和 LV5-3D-HSP27過表達慢病毒包裝，通過 LV5-3G-HSP27homo LV5-3D-HSP27homo 及LV5 NC陰性對照病慢毒載體系統轉染逼尿肌細胞。細胞在靜息狀態或0.1u M乙酰膽堿刺激后，收集體外培養的逼尿肌細胞裂解后提取細胞蛋白,然后通過免疫共沉淀和免疫印跡技術分析磷酸化的HSP27與收縮相關蛋白Ca D、TM的結合

15、能力。將p EYFP-HSP27分別和p ECFP-Ca D p ECFP-TM勺質粒共轉染膀胱逼尿肌細胞,培養48h后,激光共聚焦顯微鏡檢測蛋白 共定位情況。結果：膀胱組織中HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表達下降,并且其三個磷酸化亞型Ser15、Ser78和Ser82均顯著低于正常對照組；而Ca D和TM顯著高 于正常對照組；高糖培養組的SD大鼠逼尿肌細胞數明顯低于正常糖濃度。 逼尿肌 細胞培養中，QRT-PCR僉測高糖培養組Ca D和TM在逼尿肌細胞的表達高于正常 糖濃度組;免疫熒光檢測HSP27在高糖培養組中表達下降,并且其三個磷酸化亞型Ser15、Ser78和Ser82均顯著低于正常

16、對照組；Western blot檢測高糖組下HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表達下降,并且其三個磷酸化亞型Ser15、Ser78 和Ser82均顯著低于正常對照組，而Ca D和TM顯著高于正常對照組。LV5-3D-HSP27過表達慢病毒轉染體外培養的膀胱平滑肌細胞 ,HSP27與Ca D 共沉淀增加，LV5-3G-HSP27過表達慢病毒轉染體外培養的膀胱平滑肌細 胞,HSP27與Ca D共沉淀減少,HSP27和TM共沉淀呈陰性；激光共聚焦下p EYFP-HSP2和p ECFP-CsD共轉染組HSP27的分布與Ca D分布共定位非常接近，p EYFP-HSP2和 p ECFP-TM共轉染組HSP

17、27的分布與TM分布無明顯相關性。結 論:1.HSP27及其磷酸化水平在糖尿病膀胱組織和體外高糖培養的逼尿肌細胞中 表達、分布和轉錄水平降低,而CaD和TM平滑肌收縮相關蛋白表達和分布增高； 其中HSP27磷酸化水平的下調使逼尿肌細胞結構失去穩定性,是糖尿病膀胱收縮 功能降低的主要原因之一2.膀胱逼尿肌收縮機制之一可能為：磷酸化的HSP27增加了 CaD與其的結合,并使之發生結構變異，釋放出TM,結合肌動蛋白產生收縮；而糖尿病狀態下，低磷 酸化水平的HSP27吉合Ca D能力降低,Ca D與TM更多的綁定在一起，而TM無法 與肌動蛋白結合 , 使收縮力下降。 綜上所述 , 我們在組織層面利用

18、2 型糖尿病 ZDF 雄性大鼠模型完成膀胱壓力測試及對超微結構的觀察,并揭示高糖中HSP27磷酸 化表達下降使逼尿肌的收縮結構和收縮功能活性下調可能是DBM發病機制。其中收縮力的下調可以通過HSP27磷酸化的抑制劑或沖動劑所改變。2型大 鼠模型中將DBD與 HSP27勺磷酸化及相關收縮蛋白對平滑肌收縮功能的調節聯系 起來,來探尋DBD肌源性改變的趨勢及其機制。在細胞層面研究高糖對大鼠膀胱逼尿肌相關收縮蛋白及磷酸化轉錄和表達的影響。并揭示高糖下調了 HSP27及其磷酸化水平,而上調了 CaD和TM的表達。在通過過磷酸化的HSP2經慢病毒轉染逼尿肌細胞發現HSP27磷酸化激活了Ca D的磷酸化并與之結合,使被Ca D綁定的TM釋放而促進收縮的發生,從而解 釋了糖尿病的氧化應激從上游下調了 HSP27磷酸化而上調了 Ca D,而Ca D的活 性也需要在磷酸化的HSP27激活下與HSP27吉合發生結構變異才能釋放TM使肌 肉收縮。故可以作出以下推測：糖尿病導致HSP27和磷酸化的HSP27減少,這 種下調導致Ca D更多的與TM綁定而收縮功能下降；糖尿病導致氧化應激誘導了 更多的Ca D,而上調的Ca D因為