1、安徽農業科學，JournalofAnhuiA Sei2014，42(11)：31533155，3198責任編輯 石金友 責任校對 況玲玲響應面法優化重組畢赤酵母菌表達 D-甘露聚糖酶的誘導條件李慧玲 ，劉祖艷 ，趙敏(1東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150040；2黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040)摘要 目的對重組畢赤酵母茵表達 B一甘露聚糖酶的誘導條件進行優化。方法以重組畢赤酵母 GS115為研究對象，通過單因素試驗確定最佳產酶條件，并采用響應面試驗確定 3個因素的最佳水平。結果最佳產酶條件為：培養溫度 28，培養 pH 65，搖床轉速210rmin，培養基裝液量

2、100ml。響應面試驗確定3個因素即裝液量、甲醇添加量和 pH最佳值分別為10318ml、177和669；在此條件下，p一甘露聚糖酶的活力最大值為49175 Uml。結論驗證試驗證明模型預測值準確、可靠，為重組畢赤酵母菌的合理開發利用提供了依據。關鍵詞 重組畢赤酵母；3-甘露聚糖酶；響應面中圖分類號 S182文獻標識碼 A文章編號 05176611(2014)110315303Optimization ofExpression Conditionsof mflnnflnflse Induced by RecombinantPcha pastorsby Response Surface Meth

3、odologyLIHui-ling，ZHANG Manetal (ColegeofLifeSciences，NortheastForestryUniversity，Harbin，Heilongjiang150040；ColegeofPharma cy，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin，Heilongjiang150040)Abstract ObjectiveTooptimize theinduction conditionsoftherecombinantPichiapastoris-mannanaseMethodWithrecomb

4、inantP iapastorisGS115 asstudyobjecttheoptimalenzymeproducingconditionsandhreetfactorsoptimal levelweredeterminedbysinglefactorexperimentandresponsesurfaceexperimentrespectivelyResultTheoptimum enzymeproducingconditionsrea：temperature28，pH 65，rotatingspeed210rmin，volumeofmedium 100m1Responsesurfacem

5、ethodologywasusedtooptimizetheabovehreetfactors(volumeofme dium，methanolconcentration，pH ofmedium)withtheoptimum value10318ml，177，669，respectivelyheTBmannanaseactivitywouldreachthehighestvalue(49175Um1)underhetoptimizedfermentationconditionsConclusionThepredictedvaluesfrom theresponsesurface methodo

6、logy wereproved tobecorrectand reliableby verificationtest，which wilprovidea referenceforappropfiateutilization and develop mentofrecomb inantPichia pastorisKey words RecombinantPichia pastoris；Bmannanase；Response surfacemethodologyp一1，4一D一甘露聚糖酶 (p一1，4一Dmannan mannanohydro-lase，EC32178)，簡稱為 p甘露聚糖酶(p

7、mannanase)屬于半纖維素酶類，可以斷裂 B一1，4-D-甘露糖苷鍵 。 一甘露聚糖酶廣泛應用于紙漿、飼料和鉆井等生產領域 J。B-甘露聚糖酶存在于細菌、酵母菌、絲狀真菌和植物中 J。來 自于細菌的 B甘露聚糖酶已被分離得到，如 Baeillus subtilis WY34、Cellulosimicrobium spstrain HY一13、Sphingomonasstrain等 。克隆細菌的 B-甘露聚糖酶并且高效異源表達有助于滿足工業生產的需求。甲醇營養型畢赤酵母成功作為高水平表達異源蛋白的表達系統 “。筆者為了使構建的重組畢赤酵母表達 B甘露聚糖酶潛力充分發揮出來，優化其發酵過程，

8、以獲得較高的產物濃度。研究選用裝液量、甲醇添加量和 pH值 3個關鍵因素為 自變量，以重組 B-甘露聚糖酶的酶活力為響應值，利用響應面法(responsesurfacemethodology，RSM)進行發酵條件優化并確定最佳方案，以期為重組畢赤酵母的進一步開發利用提供依據。1 材料與方法11 材料111 供試菌株。分泌表達 B一甘露聚糖酶的重組畢赤酵母菌 Manl2，由東北林業大學微生物與免疫實驗室保存。112 主要試劑。培養基的配制方法參見 Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。作者簡介 李慧玲 (1979一 )，女，黑龍江北安人，講師，碩士，從事環境微生物和生物藥物研究。收稿 13期

9、 2014-03-0412 方法121 菌株的誘導表達。取一80冰箱保存的甘油菌接種于 YPD培養基中，劃線活化，28倒置培養。挑取菌株接種至 BMGY培養基中培養 1618h至 DD =26，離心收集菌體，用 BMMY重懸菌體，使 0D =10左右；取菌液繼續震蕩培養，每隔 24 h加入無水 甲醇誘導，誘導 72h，測定酶活性。122 粗酶液的制備。取誘導表達 Man12菌株培養液，離心后上清液即為粗酶液。123 重組 B-甘露聚糖酶活力測定方法。采用改進的 3，5一二硝基水楊酸法(DNS方法)測定酶活力 ，利用比色法測定酶解后還原產物的生成量，以表示酶的活力。酶活力定義：在一定溫度和 pH

10、下，以每分鐘生成相當于 1ixmolD一甘露糖所需酶量為一個酶活力單位(Iu)。124 培養溫度對重組畢赤酵母產酶的影響。重組畢赤酵母菌分別在 24、26、28、30和32條件下培養，以確定最佳培養溫度。 125 甲醇濃度對重組畢赤酵母產酶的影響。在 BMGY培養基中分別添加濃度為 025、050、100、150、200和 250的甲醇，誘導培養 72h后測定酶的活力，以確定甲醇的最佳添加量。126 不同 pH值對重組畢赤酵母產酶的影響。通過添加01molL的磷酸鉀緩沖液使培養基的 pH值分別達到 30、40、50、60、70和 80的培養基，經甲醇誘導表達 72 h后測定酶的活力，以獲得發酵

11、培養最佳 pH值。127 搖床轉速對重組畢赤酵母產酶的影響。重組畢赤酵3154安徽農業科學母菌搖床培養時轉速分別設定為 180、190、200、210、220和230rainr，進行培養。128 培養基裝液量對重組畢赤酵母產酶的影響。分別將50、70、100、110、120和 130ml經 BMMY重懸的菌液裝入 500 rnl三角瓶中培養，測定酶活，獲得最佳裝液量。129 響應面優化發酵條件。利用 Design。Expert軟件進行裝液量、甲醇添加量和培養基 pH3個條件的響應面分析，以B一甘露聚糖酶酶活力為響應值。2 結果與分析21 培養溫度對重組畢赤酵母產的影響 圖 1表明，培養溫度在

12、28和 30時酶活達到最大值 ，32時酶活有所下降，畢赤酵母菌生長在最適溫度的時候，生長旺盛，產酶量增加，酶活達到最大值。5 0004 000寒 3 000髓罄 200543，11 000咖咖0O2426283O32培養溫度 圖 1 培養溫度對重組畢赤酵母產酶的影響5 0004 0003 000鎏201 0000n 25旺5115225甲醇添加量 圖2 甲醇添加量對重組畢赤酵母產酶的影晌適的pH也可以減少 p一甘露聚糖酶在發酵過程中的消耗。圖 3表明，當培養基 pH值是 65的時候酶活達到最高。墨謄455O5506570培養基pH值圖 3 培養基 pH值對重組畢赤酵母產酶的影響4 0003 0

13、00毒201 000O1801902002l0220230轉速 rmin圖 4 搖床轉速對重組畢赤酵母產酶的影響24 搖床轉速對重組畢赤酵母產酶的影響 由于重組畢赤酵母生長過程耗氧量大，當搖床速度增加時，培養基中的溶解氧含量上升，有利于其生長。圖4表明，當搖床增加轉速達到 210rmin時，重組 B一甘露聚糖酶活性最大。但是當轉速進一步提高后重組酶的活性提高不大。25 培養基裝液量對重組畢赤酵母產酶的影響 圖 5表明，在 500ml三角瓶中裝入 100120 ml培養基時，產 B一甘露聚糖酶活性最高。培養基的裝瓶量影響著培養基中的溶氧量，當培養基所占體積過多時，搖瓶中的空氣含量減少，導致培養基

14、中的溶氧量降低，影響重組畢赤酵母的生長。54咖22 甲醇濃度對重組畢赤酵母產酶的影響 畢赤酵母是甲醇利用型酵母，能以甲醇為唯一的碳源進行生長。由于外源基因是整合到 AOX1下游的，因此重組畢赤酵母外源基因的墨表達受甲醇的嚴格調控。圖 2表明，當甲醇濃度在 15時 ，鎏重組 B一甘露聚糖酶活性達到最大值。在重組畢赤酵母誘導表達外源蛋白過程中：當甲醇濃度過低時，重組畢赤酵母因缺乏碳源生長受到抑制，當甲醇含量過高時，由于甲醇會導5O7O10O110120130致細胞中毒，也可使重組畢辦酵母表達外源基因受到影響，裝液量mL適宜的甲醇含量可使重組畢赤酵母高效表達外源基因 。23 不同 pH值對重組畢赤酵

15、母產酶的影響 重組畢赤酵圖 5裝液量對重組畢赤酵母產酶的影響母生產 B一甘露聚糖酶的過程涉及多種酶促反應 ，在某一 pH26 響應面優化試驗結果篩選培養基的裝液量、甲醇添值條件下 B一甘露聚糖酶會被畢赤酵母生長過程 中釋放的蛋加量和培養基 pH進行響應面試驗，以粗酶液的 B一甘露聚糖酶活力為響應值。A代表裝液量，B代表甲醇用量，c代表溶白酶所降解，因此必須添加合適 pH的緩沖溶液以穩定酵母液 pH值。采用 DesignExpert軟件建立回歸模型為 y(p-甘生長環境的 pH，以此來提高 p一甘露聚糖酶的產量。同時合3198安徽農業科學2014盎是含尿素培養基，遠遠低于對照，原因與碳源試驗相同

16、，可能是菌絲死亡了一部分，所以產量較低。因此，從多糖產量上分析，最佳氮源為黃豆粉，尿素不應作為氮源加以使用。1201OO鑿爭婀苷 80婚蘋2。0甏謄蕾饕集注：數據來源于 4個重復的平均值。無相同小寫字母表不差異顯著。圖 7 不同氮源培養基中菌絲體多糖含量3 結論該研究以人工栽培的花臉香蘑分離獲得的菌株為研究對象，采用液體培養的方法，對菌絲體進行碳源和氮源利用能力試驗，通過比較分析菌絲體麥角固醇含量和多糖含量，研究不同碳源和氮源對菌絲體生長和多糖含量的影響。通過比較分析麥角固醇含量結果顯示，果糖、甘露糖、纖維二糖、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖都可以作為花臉香蘑菌絲體生長的碳源，但相比之下，果糖、甘露糖和

17、纖維二糖是更為理想的碳源，而選擇果糖作為碳源，多糖含量則最高。丙氨酸、甘氨酸、黃豆粉和蛋白胨都可以作為氮源使用，添加丙氨酸的培養基中，菌絲生長效果最好，而含有黃豆粉的培養基中，則是多糖含量最高。不論是比較菌絲體生物量，還是分析多糖含量，其結果都顯示，在液體培養條件下，不應該選擇尿素作為氮源。(上接第 3155頁)蛋白的培養條件有一定差別，需要后期優化其發酵條件，以獲得更多的表達產物。3 結論試驗利用響應面分析方法優化重組酵母菌搖瓶培養條件，最終獲得產酶最優條件為：培養溫度為 28，搖床轉速是 210rmin，裝液量是 10318ml(500ml三角瓶)、甲醇加入量為 177 、pH是 669，

18、為重組畢赤酵母的中試發酵生產奠定基礎。參考文獻1MCCLEARY B VBInalfnanaseJMethodsin Enzymology，1988，160：5966102SCHOMBUGD，SALZMANN MEnzymeHandbokMBerlin：Springer-Verlay Berlin Heideberg，1991，1-53BENECH RO，H X，PATROND，et1aRecombinantexpression，character-ization，nda pulp pr ebleaching propey ofa Phanerochaete chrysosporiumendo

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