儲 炬華東理工大學國家生化工程技術研究中心(上海）2016.4.17， 湖北宜昌,氮源在工業發酵中的重要調控作用,2016年工業生物過程優化與控制研討會,Outline,工業發酵的重要性N源在工業發酵中的調控作用基于碳氮磷利用速率動態調控的紅霉素基因工程菌發酵過程優化基于N源調控的其他發酵產品案例用于考察N源的專用設備及多尺度參數分析結論與展望,一、工業發酵在國民經濟中的重要地位,工業生物技術在國民經濟發展中的作用,發酵工程,醫藥、輕工食品、農業、環保、能源、,社會可持續發展生物技術發展,需求,醫藥、食品領域的重要工作內容和關鍵技術,新型食品添加劑、防腐劑、功能食品,食品,微生物藥物,新藥、抗體疫苗、酶,生物能源,纖維素乙醇、生物柴油,環境保護,生物治理、生物預報,農業,農產品深加工、生物農藥與肥料,數千年歷史技術持續發展,工業生物技術基礎 社會經濟發展必須,動物細胞大規模培養,抗生素、維生素、基因產品,生物基化學品,可降解塑料、生物乙烯、1、3丙二醇,以多參數檢測相關性分析為基礎的生物過程控制優化理念,二 、N源在工業發酵中的調控作用,氮是活細胞生存所必須的營養大分子， 氮的吸收是微生物代謝的關鍵步驟。為了滿足生物對氮的需求，即使在氮限制的情況下，仍能確保充足的氮供應，因為微生物已經進化了針對不同氮源復雜的攝取和吸收機理。,培養基成分,培養基成分,水,培養基成分氮源,N源主要用于構建菌體細胞物質（氨基酸、蛋白質和核酸等）和含氮代謝物，主要可分為有機氮源和無機氮源常用的有機氮源有花生餅粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、魚粉、尿素等 在蛋白酶作用下，水解為氨基酸被吸收分解代謝 含有豐富的蛋白質、多肽和游離氨基酸外，還含有少量糖類、脂肪、無機鹽、維生素及某些生長因素，因此微生物在此環境下能夠生長旺盛，菌濃增長迅速,源在工業發酵調控中的作用,促進生長，調節初級代謝及次級代謝的通量控制合適水平，啟動次級代謝產物形成控制生長速率，影響菌型形成，從而影響發酵液流變特性影響供氧水平，增加功率消耗,氮源在發酵過程中的作用,菌體生長,產物代謝產物、生物轉化、酶、生物量,氮源,碳源：CO2,無機氮源：硫酸銨、硝酸銨、氨水、,有機碳源：玉米漿、黃豆餅粉、尿素、酵母粉、,促進生長，調節初級代謝及次級代謝的通量,N源的選擇與篩選,不同菌種對不同N源的利用度、利用速率不同黃豆餅粉：紅霉素 酵母粉： 阿維菌素、肌苷/鳥苷、基因工程菌魚粉：螺旋霉素 玉米漿：青霉素無機氮源與有機氮源的組合不同有機氮源的組合、搭配碳、氮源的搭配,在線監控考察N源的質量、可利用度和替代效果,背景,N源調控分子機制的理解，有助于發酵過程工藝的改進,Maltose,優先利用,受抑制,S.erythraea,Carbon Catabolite Repression(CCR):菌體優先利用PTS轉運的碳源，ABC系統轉運的碳源利用受抑制,發酵過程中增加ABC轉運系統碳源能有效降低發酵成本。,培養基糖成本不斷上升,背景,N源調控分子機制的理解，有助于發酵過程工藝的改進,研究發現，N源全局調控子GlnR能夠激活ABC型轉運基因，促進麥芽糖、甘露糖等CCR碳源的利用,降低發酵成本,Proc Natl Acad Sci, 2015,10.1073; Biochem Biophys Res Commun.2016.02.044,背景,N源調控分子機制的理解，有助于發酵過程工藝的改進,N源全局調控子GlnR和P源代謝雙組分系統PhoP存在相互調控關系，并使N調控和P調控存在交叉。,培養基豆餅粉過多，使發酵后期N、P源釋放增多，PhoP會促進GlnR表達，抑制紅霉素合成,eryAI,解釋發酵現象,培養基優化,Appl Environ Microbiol, 82(1), 409-420于曉光，儲炬. 磷氮調控對紅霉素重組工程菌ZL1004發酵過程的影響,三、基于碳氮磷利用速率動態調控的紅霉素基因工程菌發酵過程優化,問題：玉米漿質量不穩定引起紅霉素產量波動大,1 紅霉素基因工程菌發酵培養基氮源優化與中試放大,解決方案：采用質量穩定的酵母浸粉和酵母粉作為速效有機 氮源,黃豆餅粉33g/L、面包酵母浸粉6.0g/L， 發酵水平比對照提高了6.3%。,黃豆餅粉33g/L、啤酒酵母浸粉6.0g/L， 發酵水平比對照提高了20.6%。,黃豆餅粉33g/L、酵母粉10g/L， 發酵水平略高于對照。,面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,對照培養基1培養基2培養基3培養基4培養基5,酵母粉培養基1酵母粉培養基2酵母粉培養基3,不同速效氮源下的淀粉酶和蛋白酶活比較,1 紅霉素基因工程菌發酵培養基氮源優化與中試放大,采用新型速效有機氮源后，胞外淀粉酶和蛋白酶活力大大提高，表明新型氮源下，菌體利用淀粉和黃豆餅粉的能力增強。,玉米漿面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,玉米漿面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,酵母粉培養基1酵母粉培養基2酵母粉培養基3,酵母粉培養基1酵母粉培養基2酵母粉培養基3,紅霉素效價提高15.9%,15L罐二級種子比較,50L罐發酵水平比較,玉米漿種子酵母粉種子,1 紅霉素基因工程菌發酵培養基氮源優化與中試放大,25m3罐發酵水平比較,酵母粉種子培養基優化及25噸罐放大,采用酵母粉后的發酵水平比對照組提高了21.7%，紅霉素A提高了13.0%。,50L罐發酵水平比較,1 紅霉素基因工程菌發酵培養基氮源優化與中試放大,酵母粉替代玉米漿對工業生產菌發酵的影響,采用酵母粉后的發酵水平和A組分比對照組提高了分別提高了15.3%和14.4%。,工業生產菌,采用新型速效有機氮源替代工業培養基中的玉米漿成分，并對種子培養基和發酵培養基進行優化，成功實現了25噸罐規模下紅霉素產量的大幅提升（21.7%）。采用新型氮源速效有機氮源，實現了工業生產菌紅霉素效價的大幅提升（15.4%）。新型速效氮源解決了玉米漿質量不穩定引起紅霉素產量波動大的問題,1 小結,問題：發酵液粘度過高,解決方案：調節培養基成份,Kanda M, Yamamoto E, Hayashi A, et al. Scale-up fermentation of echinocandin type antibiotic FR901379. Bioscience and Bioengineering. 2010,109(2): 138-144,采用無機銨鹽結合添加營養因子而非傳統有機氮源已經成功地使棘白霉素類抗生素發酵液粘度降低了50%。,發酵液中殘留的黃豆餅粉是影響菌體分離提取過程的重要因素,Davies JL, Baganz F, Ison AP, et al. Studies on the interaction of fermentation and microfiltration operations: erythromycin recovery from Saccharopolyspora erythraea fermentation broths. Willey and Sons Inc. 2000,64(4): 429-439,指導思想：分析有機氮源、無機氮源對粘度的貢獻， 盡量降低黃豆餅粉的濃度,2.無機氮磷調控降低發酵液粘度和葡萄糖消耗,發酵液平均粘度降低18.6%。發酵過程補糖總量降低61.6%。紅霉素A產量為7926U/ml，相當于對照（8069U/ml）。,A.氮源與粘度關系考察及多尺度相關性分析,硫酸銨敏感參數,培養基設計表,銨離子抑制蛋白酶活性，使菌體利用無機銨而非黃豆餅粉。銨離子的利用導致補糖速率降低。黃豆餅粉中有機磷的釋放限制了菌體OUR水平。磷限制了銨離子的利用，避免了高濃度銨離子的阻遏作用。,初始培養基高酵母粉培養基高硫酸銨培養基,初始培養基高酵母粉培養基高硫酸銨培養基,初始培養基高酵母粉培養基高硫酸銨培養基,初始培養基高酵母粉培養基高硫酸銨培養基,A.氮源與粘度關系考察及多參數相關性分析,高硫酸銨培養基,Strategy 1,Strategy 2,Strategy 3,添加0.2g/L磷酸二氫鉀,降低豆粉濃度30g/L20g/L,降低硫酸銨8g/L6g/L,降低粘度、降低糖耗,B.氮磷調節實現低粘度低糖耗的紅霉素發酵新工藝及代謝機理考察,論文發表：Chen Y. et al. Bioresource Technology (2013),紅霉素A:策略1提高5.9%，策略2提高10.6%,策略3提高9.6%。策略1、2、3下的葡萄糖消耗速率大幅降低。策略1的粘度略有增加，策略2粘度降低至2084cp，策略3下的粘度為1598cp。,培養基調整后的紅霉素A、葡萄糖消耗、粘度比較,B.氮磷調節實現低粘度低糖耗的紅霉素發酵新工藝及代謝機理考察,添加磷酸鹽后，氨基氮消耗速率增加，減豆粉后氨基氮消耗速率更低，表明磷酸鹽和減豆粉增加了銨離子的消耗。氨基氮與葡萄糖消耗速率間的關系表明，銨離子降至低水平時，由銨離子引起的pH降低的效果減弱，同時較多的黃豆餅粉被利用使pH升高。葡萄糖不是發酵液粘度高的直接原因。,高硫酸銨培養基策略1策略2策略3,B.氮磷調節實現低粘度低糖耗的紅霉素發酵新工藝及代謝機理考察,添加無機磷后增加了發酵后期黃豆餅粉的水解速率，特別是銨離子降低到較低水平階段。氨基酸脫氨基后生成紅霉素合成前體，因而氨基酸濃度影響紅霉素的合成。發酵后期充足的紅霉素前體氨基酸庫是紅霉素產量提高的重要因素,發酵液中氨基酸濃度表,氨基酸代謝與紅霉素合成,B.氮磷調節實現低粘度低糖耗的紅霉素發酵新工藝及代謝機理考察,丙酸濃度的增加可理解為較低補糖速率下正丙醇利用速率增加，正丙醇通過甲基丙二酰-CoA和琥珀酰-CoA生成了琥珀酸或通過甲基檸檬酸途徑生成琥珀酸。可以適當控制葡萄糖補加速率來降低乙酸的生成。,發酵液中有機酸濃度比較,丙酸、琥珀酸和乙酸的關系,B.氮磷調節實現低粘度低糖耗的紅霉素發酵新工藝及代謝機理考察,綜合調節無機銨鹽、無機磷、有機氮源的濃度，成功實現了降低發酵液粘度和葡萄糖消耗速率，同時提升了紅霉素A的水平。,葡萄糖不是紅霉素合成的直接限制因素。葡萄糖補加速率低的原因：銨離子抑制了黃豆餅粉的利用和銨離子消耗伴隨氫離子的生成。磷限制條件下，黃豆餅粉中有機磷的逐漸釋放使銨離子利用速率較低，避免硫酸銨阻遏作用。,發酵后期充足的前體氨基酸庫有利于維持較高的紅霉素合成速率。,2 小節,問題：黃豆餅粉中有機磷的釋放使發酵后期溶磷較高，引起 粘度高,解決方案：尋找低磷含量有機氮源，替換高磷含量有機氮源， 控制發酵中后期的溶磷水平。 在發酵初期補加無機磷，增加發酵前期的菌體生長,關于磷酸鹽對紅霉素發酵的影響的報道多為化學合成培養基，且表明較高的無機磷阻遏紅霉素的合成。,L.M.Reeve, S.Baumberg. Physiological controls of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea are exerted at least in part at the level of transcriptionJ. Biotechnology Letters, 1998, 20(6):585-589.,由于工業復合培養基中，復合有機氮源中含有一定量的磷，所以很少有人研究有機氮源磷含量對發酵過程的影響。,指導思想：保證總氮大體不變的條件下，降低發酵后期溶 磷的釋放 通過流加無機磷，增加發酵初期磷的利用速率,3.不同磷含量氮源組合及無機磷補加調控發酵過程磷水平,玉米蛋白粉的磷含量為黃豆餅粉的53%酵母粉中的磷含量高達0.87%。有機氮源較高的磷含量使發酵后期的溶磷水平較高。,不同氮源的磷含量測定結果,A 不同氮源的磷含量測定結果,粘度降低、溶磷降低、效價相當。,采用玉米蛋白粉替代黃豆餅粉,B 降低有機氮源磷含量控制發酵后期溶磷水平,培養基調整后的發酵過程參數比較,對照培養基1培養基2,對照培養基1培養基2,對照培養基1培養基2,對照培養基1培養基2,采用玉米蛋白粉替代酵母粉,培養基2紅霉素效價11513 U/ml紅霉素、A組分為8697U/ml。,培養基調整后的發酵過程參數比較,降低有機氮源磷含量控制發酵后期溶磷水平,對照培養基紅霉素效價10974U/ml，A組分8312U/ml。,培養基1下的紅霉素效價為9691 U/ml、A組分為7676 U/ml。,無機磷替代速效氮源酵母粉,6g/L酵母粉時，流加磷酸鹽紅霉素效價高達13273 U/ml，比初始對照提高了20.9%,B. 降低速效氮源酵母粉結合無機磷流加,培養基調整后的發酵過程參數比較,采用玉米蛋白粉和黃豆餅粉組合后，粘度峰降低、溶氧增加，轉速由630r/min降至498r/min。紅霉素效價A組分提高9.4%，雜質組分降低。降低原因為傳質的改善。,C. 低磷含量有機氮源在生產菌發酵的應用,發酵液中紅霉素組份濃度比較,采用高、低磷含量氮源組合及流加無機磷的策略，提升了紅霉素的產量，降低了發酵液的粘度。,采用高、低磷含量氮源組合降低了生產菌發酵液的粘度，同時維持與對照相當的紅霉素效價。,紅霉素產量高達13273 U/ml，比未補加磷酸鹽時的效價提高了20.9%。并在500L規模罐成功放大。,揭示了無機磷和有機氮源中的磷在紅霉素發酵過程的重要作用。,3. 小節,總結,采用多尺度多參數相關性分析獲得的碳氮磷利用規律為進一步紅霉素工藝改進提供指導作用，同時為其它相關抗生素發酵提供參考。這些實驗結果為進一步在分子、酶學等水平深入研究代謝機理提供了新的切入點。,輔酶Q10氮源限制與合成代謝之間關系上的應用,基于N源調控的其他發酵產品案例,氮源-代謝,不同稀釋倍數氮源濃度對發酵影響,輔酶Q10氮源限制與合成代謝之間關系上的應用,調整氮源補加量,輔酶Q10氮源限制與合成代謝之間關系上的應用,不同氮源的合理搭配利用速效氮源：氨基態氮和玉米漿，促進菌體生長，但對部分產物，特別是次級產物合成有抑制作用。緩慢氮源：延長產物合成期。,工業糖化酶發酵補料培養基優化,棉籽蛋白和糖蜜對酶活差值的交互作用的響應面圖和等高線圖,工業糖化酶發酵補料培養基優化,糖蜜和硫酸銅對酶活差值的交互作用的響應面圖和等高線圖,工業糖化酶發酵補料培養基優化,棉籽蛋白和硫酸銅對酶活差值的交互作用的響應面圖和等高線圖,工業糖化酶發酵補料培養基優化,優化后的補料培養基配方：新型有機氮源4.19g/L，糖蜜9.01g/L，硫酸銅0.015g/L。最終，優化補料罐的酶活達到18327.5 AGI/mL，比對照罐（16460 AGI/mL）增加了11.35 %。,氮源利用與產品質量控制,1. 大腸桿菌表達海藻糖合成酶,表1. 培養基組成,對照組為OXOID 氮源，實驗組為安琪酵母浸粉（FM405、FM802、FM803、FM808、FM888、FM906，共六種）和蛋白胨（FP103、FP318、FP803，共3種），進行完全替代,不同氮源情況下的菌濃,不同氮源情況下的酶轉化率,2. 莫西菌素發酵,表1. 氮源等量替換,不同氮源情況下的總效價和PMV,表2. 氮源含量（LM902）優化實驗,不同LM902含量下的的總效價和PMV,表3. 安琪酵母膏與國藥酵母膏成本分析（單罐）,3. 頭孢菌素C發酵,不同氮源對頭C發酵的影響,4. 土霉素發酵,不同氮源對土霉素發酵的影響,土霉素發酵前期補2-3次酵母粉，放罐單位比對照高1500u/ml。青霉素發酵47小時開始加尿素，每6小時補加一次，結合補加乳糖，發酵單位可達40000u/ml以上。赤霉素生產補加的氮源是花生粉，配16的花生粉液體，當菌生長到粘度大于15秒時，說明氮源被消耗很多，就開始補加花生粉。對于含氮產物的生產特別需要補氮。,四、用于考察N源的專用設備及應用,用于考察N源的專用設備及應用,Scale up,Scale down,微型化,高通量,標準化,多尺度菌種表型研究,在線顯微儀研制,申請PCT專利（美國PCT/CN2008/071348 ）,HEK293細胞,微載體細胞,用于考察N源的專用設備及應用,在線顯微鏡在放線菌和酵母培養過程中形態變化的采集,活細胞傳感器與在線參數采集整合,活細胞傳感儀測定分析,總體目標,利用高通量技術培養，建立紅曲霉的微型化培養及批量檢測方法,高通量培養和篩選技術,改良菌種,改善發酵條件,液態發酵,用于考察N源的專用設備及應用,高通量培養技術,裝液量：500 2000 ul,24孔,48孔,96孔,固體培養和菌種保藏,用于考察N源的專用設備及應用,可滅菌、重復使用壽命長、成本低、易清洗、能統一標準、防交叉污染、透氣性好、防止水分蒸發,孔板蓋,用于考察N源的專用設備及應用,微孔板固定架,板數：882128,孔數：128243072 128486144 1289612288,用于考察N源的專用設備及應用,84h,50 L,Shake flaskfor 48h,Experimental design,Oxygen supply,Shear force,Preliminary exploration in shake flask,用于平行研究用的八聯罐系統,Shear force,400rpm,500rpm,600rpm,700rpm,26,27,29,30,Primary cultivation in 50L bioreactor for 80h,Transfer,Continued cultivation in 8 joint fermenters fo