大連大學研究生學位論文開題報告學 號： 姓 名： 導師姓名： 研究方向：羥考酮的藥效學與藥代動力學論文題目：羥考酮對小鼠全腦缺血再灌注損傷干預效果的影響院（系）：麻醉學系入學時間： 2007年 9 月 5日開題時間： 2008年 11月 5日二八年十一月五日學位論文開題報告評審表姓 名 導師姓名 第一次開題專 業麻醉學所屬院（系）麻醉學系類 別博士 碩士 碩博連讀論文選題題目名稱不同時間甘露醇脫水對小鼠腦缺血再灌注損傷干預效果的影響性質（）基礎理論研究（） 應用性研究（） 開發性研究（）類別（）國家項目（ ） 合作項目（ ） 省（部）項目（ ）自選項目（ ） 其它項目：姓 名職 稱工作單位及職務簽字組長評審組成員總成績 票同意 票不同意綜合分均分：評審意見（含：選題意義；實驗條件；技術方案可行性；研究計劃合理性等）評審組長簽字： 年 月 日注：一半以上不同意或評價綜合分低于C+（70分）者，必須重新開題一、立論依據（包括研究意義、國內外研究現狀分析，并附主要參考文獻及出處）（一） 研究意義臨床麻醉中各種原因引起圍術期的心肺功能受損，如心跳驟停、急性呼吸道梗阻等，都會不同程度的存在腦缺血再灌注損傷。麻醉期間意外發生率為5.244.3/萬，猝死率為2.87.0/萬1。急救過程中，腦復蘇環節是保證遠期復蘇效果的關鍵。現階段大多數對腦缺血再灌注損傷干預措施的研究集中于缺血再灌注損傷發生前的預處理，報道對腦缺血再灌注損傷有預防作用的涉及地氟烷2、異氟烷3、異丙酚4、氯胺酮5等等眾多臨床常用藥物。由于臨床意外難以預見，及在腦缺血再灌注后死亡細胞和凋亡細胞的不可逆性，預處理的思路常常無助于臨床意外中對腦損傷的治療。我們認為改善缺血再灌注后腦的功能，應該積極關注腦缺血再灌注后的變性神經元，建立穩定，可靠，適用于對腦缺血再灌注損傷后變性神經元救治實驗的動物模型具有探索價值。 羥考酮主要作用部位是中樞神經系統, 其次是平滑肌, 其藥理作用主要是鎮痛, 其他還包括鎮咳、縮瞳、惡心、嘔吐、瘙癢、呼吸抑制、胃腸蠕動降低等。研究認為羥考酮的鎮痛作用可能與、受體有關 , 盡管其精確作用機制現在還不明確, 但現已確定羥考酮產生呼吸抑制是通過直接作于腦干呼吸中心, 其鎮咳是通過直接作用于髓鞘咳嗽中心而起作用 。羥考酮精神依賴性的形成與紋狀體多巴胺釋放量增加有關 。（二）國內外研究現狀1 腦缺血再灌注損傷的機制 一般認為在生理情況下，神經元以氧化磷酸化的方式提供足夠的ATP維持細胞的正常代謝活動。缺血時，氧和葡萄糖供應停止，能量代謝先受累，此時神經元以無氧酵解的方式可提供少量ATP以維持細胞完整性。但由于無氧酵解過程中產生過量乳酸，使細胞酸中毒，而神經遞質的合成、釋放和攝取均受PH的影響，因而神經元的功能遭到破壞。例如能量障礙引起Na+丟失，使突觸前膜去極化，導致興奮性神經遞質谷氨酸釋放增加，又由于酸中毒使谷氨酸攝取受阻，突觸隙內有谷氨酸堆積，通過大量激活其NMDA受體，致Ca2+內流增加，胞內鈣超載，但此時依賴能量的離子泵Ca2+受損，無法將Ca2+排出胞外，細胞內過量的Ca2+引發一系列生化反應，如自由基及過氧化物生成，細胞因子釋放及炎癥反應等，最終造成對神經元的損害，但其中許多環節尚未闡明，有待更多學者的進一步研究。62目前關注的腦保護的方法有：（1） 低溫7；（2） 麻醉藥物的應用（包括吸入麻醉藥、靜脈麻醉藥及某些局麻藥）8；（3） 血液稀釋；（4） 離子通道阻滯藥、自由基和脂質過氧化酶抑制劑9；（5） 預處理，包過藥物預處理和缺血預處理10；（6） 中藥參附注射液、川穹嗪等113羥考酮與腦缺血再灌注損傷正常時海馬結構包括：連合前海馬、灰被、束狀回、海馬、齒狀回以及下托。海馬可分為四個區：CA1:海馬水平部的背內側部分和垂直部的后內側部分；CA2：海馬水平部的背外側部分和垂直部的前外側部分；CA3：海馬水平部的腹外側部分和垂直部的前內側部分；CA4：冠以齒狀回的部分，即齒狀回的多形細胞層。從海馬的腦室面向海馬溝觀察，可見下列層次：室管膜層、槽層、多行細胞層、椎體細胞層、輻狀層、腔隙層和分子層；再向外則是齒狀回的分子層、顆粒層和多行細胞層。正常海馬CA1區2-3層錐體細胞，胞體短徑10-20m，長徑20-30m，細胞排列緊密，層次分明，核大而圓，核膜完整，核仁清晰，核染色質均勻12。國內有報道沙土鼠缺血再灌注后CA1區多數神經元變形壞死，表現細胞腫脹，胞漿內形成空泡，核呈不規則固縮，深染等，甘露醇治療組僅有個別神經元變性壞死。可見從形態學角度說明甘露醇有神經元保護作用。但這方面小鼠的實驗報道不多。4目前常見的全腦缺血動物模型： （1）雙動脈阻斷法（同時阻斷雙側頸總動脈和基底動脈）13 （2）三動脈阻斷法（同時阻斷雙側頸總動脈和基底動脈）14 （3）四動脈阻斷法（同時阻斷雙側的頸總動脈和椎動脈）15 三動脈阻斷法和四動脈阻斷法的缺血程度較雙動脈阻斷法為重，再灌注后的腦組織也會不同程度的產生梗死灶，梗死灶周邊的變性細胞或散在分布，或和梗死灶重疊，不能形成較好的觀察區域。 雙動脈阻斷法建立小鼠全腦缺血再灌注損傷模型，用激光多譜勒灌注監測儀測定，在缺血后10 min腦皮質血流為缺血前腦皮質血流的22.3%16, 接近大多數臨床意外時腦缺血的情況，且對實驗動物造成的應激性生理及病理反射較小17。實驗觀察了昆明小鼠雙頸總動脈阻斷30120 min再灌注24 h后的腦缺血再灌注損傷效果，通過分析海馬CA1區細胞的形態學特點，認為昆明小鼠缺血60 min再灌注24 h造成的損傷程度適中，不同程度的受損細胞比例均衡，可作為以變性神經元為觀察對象，在腦缺血后實施干預的腦缺血再灌注損傷動物模型，相對于其他實驗動物及模型制作方法，具有成本低廉、操作簡便、重復性好的特點。在此實驗動物平臺上分別成功的進行了腦缺血再灌注損傷后納洛酮和皮質激素干預效果的觀察和評價。 本課題就是在上述同學的工作基礎上，進一步完成腦缺血再灌注損傷后不同時間甘露醇脫水治療的效果評價和實驗動物觀察。 【主要參考文獻】1 王玉明，李小平，李江明.麻醉與猝死.北京軍區醫藥J.1999,11(5):365-3682 羅芳，候麗賢，王恩真,等.地氟烷對全腦缺血再灌注損傷大鼠腦神經元及細胞骨架的可能性保護作用.中國臨床康復J.2005,9(14):2153 孫永海，岳云，王云.異氟烷預處理對大鼠全腦缺血損傷的保護作用及遞質機制.軍醫進修學院學報J.2005,26(5):392-3944 郭建榮，崔健君，黃長順,等.異丙酚對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織細胞間黏附分子-1及核轉錄因子-B表達的影響.中華麻醉學雜志J.2005,25(2):122-1255 范圣登，謝紅，王明才,等.氯胺酮對大鼠全腦缺血再灌注損傷的預防與治療作用.江蘇醫藥雜志J.2003,29(10):741-7426 彭靜，鄢建勤.烏司他丁與腦保護，2007麻醉學新進展，2007：46477 包正夫, 徐蔚. 低溫腦保護技術的現狀與進展 J . 昆明醫學院學報,2007,24 (1) : 1071098 陳伯蠻李德馨. 麻醉藥對腦功能和腦代謝的影響和腦保護 J . 國外醫學麻醉學與復蘇分冊，2003，24(1)：129 曲友直，高國棟，趙振偉等. 甘露醇、尼莫地平及其兩藥聯合應用對腦缺血大鼠神經保護作用的機制研究 J . 中國臨床康復，2004，8（4）：65865910 甘國勝, 王焱林. 藥物預處理在顱腦手術圍術期的腦保護作用的研究進展 J . 中國誤診學雜志,2006 ,6 (8):1443144511 王瑜. 中藥治療腦缺血及對腦保護作用的研究 J . 中醫藥學刊，2 0 0 2 ，2 012 王平宇，朱治遠，等大白鼠中樞神經系統解剖學基礎2003：343913 EklofB, Siesjo BK. The effect of bilateral carotid artery ligation upon the blood flow and the energy state ofthe rat brain J . Acta Physiol Scand, 1972, 86:155165.14 Kameyama M, Suzuki J , Shirane R, et al. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the rat three vessel occlusion model J . Stroke, 1985,16: 489493.15 PulsinelliWA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat J .Stroke, 1979, 10: 267272.16 盧曉梅,金玉梅. 燈盞花素對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響J. 錦州醫學院學報,2006,27(1):44-4617 賈棟，高國棟.大鼠全腦缺血/再灌注模型之比較研究.卒中與神經疾病J.1999,6(3):145-148二、研究方案（一）研究目標、研究內容和擬解決的關鍵問題1. 研究目標探索不同時間羥考酮處理對小鼠全腦缺血再灌注損傷干預效果的影響。 2. 研究內容（1）光鏡下觀察正常小鼠海馬CA1區神經元的形態學表現 （2）光鏡下觀察不同處理組小鼠海馬CA1區神經元的病理形態學變化 （3）光鏡下觀察不同時間甘露醇干預后的小鼠海馬CA1區神經元的病理形態學變化 3. 擬解決的關鍵問題（1）按照郗東峰同學的方法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型。 （2）準確完成不同時間的甘露醇干預（3）完整取腦，正確選取觀察部位的腦組織。（4）客觀描述病理形態學標本所見（5）準確統計病理形態學指標（6）適當的統計學處理，導出實驗結論（二）擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析 1. 研究方法健康昆明小鼠42只，隨機分為對照組、假手術組、缺血再灌注損傷組和羥考酮干預組。按照結扎雙側頸總動脈法制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型。進行腦組織海馬CA1區神經元細胞計數，光鏡觀察海馬CA1區神經元病理形態學的改變，并計算變性細胞率。2. 技術路線取腦組織固定、石蠟包埋切片對照組(n=6)健康昆明小鼠42只再灌注1.5h羥考酮干預組(n=6)再灌注1h羥考酮干預組(n=6)再灌注30min羥考酮干預組(n=6)假手術組(n=6)缺血再灌注損傷組(n=6)再灌注即刻羥考酮干預組(n=6)再灌注24h后取腦組織固定、石蠟包埋切片數據處理、統計學分析、得出結論HE染色光鏡細胞計數、形態學觀察3 實驗方案（1） 實驗分組：健康昆明小鼠42只（山西省腫瘤醫院實驗動物中心提供），雌雄不分，體重202克左右，隨機分為對照組（A組，n=6）、假手術組（B組，n=6）、缺血再灌注損傷組（C組，n=6）和再灌注即刻羥考酮干預組（D1組，n=6） 、再灌注30min羥考酮干預組（D2組，n=6） 、再灌注1h羥考酮干預組（D3組，n=6）和再灌注1.5h羥考酮干預組 （D4組，n=6）。D組給予羥考酮1g/kg腹腔注射。 （2） 動物模型制備：手術在室溫25、濕度50%的條件下進行。用0.6%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（60mg/kg），絡合碘消毒，鋪單，行頸部正中切口，分離兩側頸總動脈，用3-0絲線打活結阻斷頸總動脈，1h后實現再灌注。縫合切口，置清潔飼養籠中觀察。 A組既不手術也不給藥。 B組只分離雙側頸總動脈，穿線，但不結扎。 C組分離雙側頸總動脈，結扎 1h后再灌注，但不給藥。 D1 、 D2 、 D3 、 D4組分別在再灌注即刻、30min、1h和1.5h腹腔注射甘露醇1g/kg。各組再灌注24h后0.6%戊巴比妥鈉（90mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速取腦。（3） 檢查指標和方法標本置于4%多聚甲醛液中固定24h后，取視交叉后的組織，常規石蠟包埋，冠狀切片，片厚5m,蘇木精-伊紅染色（HE染色），光鏡下在有測微尺顯微鏡下（10）計數海馬CA1區2mm范圍內核完整的存活細胞數（自CA1區始點起），并觀察海馬CA1區細胞形態變化，并計算變性細胞率。（4） 統計分析：實驗數據以均數標準差（）表示，采用單因素方差分析，組間進行多重比較，各組變性細胞率用X2檢驗比較，SPSS11.5統計軟件分析，P0.05認為有顯著性差異。4. 可行性分析：（1）2005級研究生吳曉陽已經建立了穩定的小鼠全腦缺血動物模型。2006級研究生田彥鵬在此實驗動物平臺上分別成功的進行了腦缺血再灌注損傷后納洛酮和皮質激素干預效果的觀察和評價。（2）本實驗參考大量相關文獻。（3）實驗經費已落實。（三）本課題的創新之處（1）國內多數報道的是腦缺血再灌注損傷前的藥物干預，以梗死和凋亡為觀察指標。本課題利用小鼠腦缺血再灌注損傷模型，再灌注后采用甘露醇干預，以變性細胞為觀察指標。（2）本課題通過觀察不同時相應用甘露醇后的效果，為臨床應用尋找合適的時間，從而為臨床心肺腦復蘇提供實驗依據。（四）研究計劃及預測進展2015年7月2015年11月 文獻檢索及撰寫綜述2015年12月2016年2月 實驗準備、預實驗2016年3月2017年6月 實驗階段2017年7月2017年9月 實驗數據處理、論文撰寫（五）.預期研究成果（1）以形態學為依據，證明羥考酮再灌注后干預可改善小鼠腦缺血再灌注損傷，起到腦保護的作用，而且羥考酮干預的時間應該是越早越好，為臨床救治過程中的心肺腦復蘇的藥物治療提供了理論和實驗依據。（2）預期提交學術論文1-2篇。 三、研究基礎1. 與本課題有關的，前期研究工作積累和已取得的研究工作成績已閱讀大量國內外相關文獻，并撰寫了有關綜述。基本掌握實驗所需的各項操作技能及各項指標的測量方法。前期的研究工作是成功建立了兩動脈阻斷法小鼠前腦缺血再灌注損傷模型，該方法簡單易行，成功率高，并用羥考酮、納洛酮和皮質激素干預的效果證實了此實驗平臺的有效性。2. 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑（包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況）（1）學術條件導師和實驗室的老師具有豐富的學識、寶貴的經驗，可以提供技術指導。圖書館可獲得大量文獻資料。統計學、及其他教研室的老師可以給予指導。（2）設備和實驗條件大連大學附屬中山醫院動物實驗中心可提供實驗動物、實驗儀器設備。研究生開題報告評分表姓 名郭文義學 號Sc2007122導師姓名趙嘉訓院（系）麻醉學系教 研 室麻醉第一次開題論文題目不同時間甘露醇脫水對小鼠腦缺血再灌注損傷干預效果的影響評價內容評價參考打分標準參考分數立論依據研究意義l 有重要科學意義或國民經濟建設中的重要科技問題l 對學科發展有促進或有應用前景l 屬一般問題l 科學意義或應用前景不大10842學術思想l 有明顯的創新l 有一定的創新和特色l 創新性不強l 無創新151262立項依據（博士生可附查新報告）l 充分，科學性強l 較充分，科