產淀粉酶菌株的分離純化一、 實驗目的 1. 掌握產淀粉酶菌種的分離純化的原理和方法技術； 2. 鞏固十倍稀釋法。二、 實驗原理土壤是微生物生活的大本營，是尋找有重要應用潛力的微生物主要的菌源。因此本實驗選擇從土壤中分離出產淀粉酶菌種，再進行純培養。主要運用富集培養技術，稀釋涂布平板法和平板劃線分離法及無菌操作技術獲得我們所需要的產淀粉酶菌種。淀粉酶作用于淀粉時，打開了淀粉分子的糖苷鍵，從而使淀粉失去粘性，同時使其失去了與碘的顯色反應能力，不再與碘結合，從而形成透明圈。產淀粉酶菌株在選擇培養基上培養后，會水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤為明顯。三、 實驗材料1. 菌種： 從自然界篩選獲得的淀粉酶產生菌種2. 土壤樣品： 從栽種土豆的菜園中采集土壤樣品3. 培養基：淀粉液體培養基（50mL）： 蛋白胨 0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉 0.1g，蒸溜水 50mL。淀粉瓊脂培養基 (200mL)： 蛋白胨 2g，NaCl 1g，牛肉膏 1g，可溶性淀粉 0.4g，蒸溜水 200mL，瓊脂 3-4g。 牛肉膏蛋白胨培養基 (200mL)： 蛋白胨 2g，牛肉膏 0.6g，NaCl 1g，瓊脂 3-4g，蒸餾水 200mL，pH7.0-7.2。4. 其他用品：酒精燈、移液槍（20-200uL）、接種環、試管架、三角涂布棒（各一個），電子天平、三角燒瓶（5個）、試管（10支）、培養皿（15個）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、無菌水（200mL）、微波爐、盧戈氏碘液。四、 試驗方法1樣品采集 用無菌報紙，在栽有土豆的菜園里，從不同的采樣點采取土樣約15g。（注意應采取距地表2-3cm以下的土樣）2富集培養取土樣10g，放入盛90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振動20min，使土樣與水充分混合，使微生物分散開。用一支1mL的移液管移取1mL土樣液，加入到盛有50mL淀粉液體培養基的三角瓶中進行富集培養，搖床110r/min，37，培養24h。3涂布平板分離倒平板 將淀粉瓊脂培養基融化后倒平板（12個），每平板約15ml。（注意平皿中的培養基厚度要均勻）土壤稀釋液的制備 取富集培養液1mL，放入盛9mL無菌水的試管中，充分振勻，此為10-1稀釋液，以此類推制成10-2 ，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和10-8幾種稀釋度的土壤溶液。涂布 將上述培養基的平板底部用記號筆分別寫上10-5，10-6，10-7和10-8四種稀釋度字樣，每種培養基每種稀釋度標記3皿，然后用移液槍分別由10-5，10-6，10-7和10-8四種土樣稀釋液中吸取0.1ml菌液放入寫好稀釋度的平板中央位置，用無菌涂布棒在培養基表面輕輕地涂滿整個平面，室溫下靜置5-10min。培養將平板倒置在37溫箱中培養48h。4. 檢測 觀察細菌的生長情況，打開平板蓋子，加入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉平板，使碘液鋪滿整個平板，觀察是否有水解圈的產生。5產淀粉酶菌株的純化倒平板 將牛肉膏蛋白胨培養基融化后倒平板（12個），每平板約15mL（注意平皿中的培養基厚度要均勻）平板劃線選擇在10-5，10-6，10-7和10-8四個稀釋度下，每組淀粉瓊脂培養基中產生透明圈最大的1個菌落，用無菌水將碘液沖洗掉，挑取遠離透明圈的少許菌苔，在3個牛肉膏蛋白胨培養基平板上劃線接種。培養將平板倒置在37溫箱中培養48h。6鑒定保存觀察細菌的生長情況，打開平板蓋子，加入少量盧戈氏碘液于平板種，輕輕旋轉平板，使碘液鋪滿整個平板。觀察能產生透明圈的菌落特征，進行初步鑒定，并接種到牛肉膏斜面上保存。五、 技術路線 樣品采集富集培養（110r/min，37，24h） 倒平板（淀粉瓊脂培養基12個） 土壤稀釋液制備 涂布 培養（37，48h） 加碘液（觀察是否有淀粉水解圈產生