多重PCR檢測金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的研究劉繼超，姜鐵民，姜阿赤，陳歷俊*（北京三元食品股份有限公司，北京100076）摘要：目的：為了建立一種簡單、快速檢測金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的多重PCR方法。方法：根據相關文獻和Genebank報道的編碼金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E、H的基因序列，選擇合成了6對特異性引物，建立多重PCR體系，并對反應條件進行了優(yōu)化。結果：6對引物能同時特異地擴增出120bp、478bp、257bp、319bp、170bp和375bp的目的片段，表明6對引物具有良好的特異性。結論：本研究成功地建立了一種同時檢測金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的多重PCR方法，在金黃色葡萄球菌腸毒素快速篩查方面具有良好的應用前景。關鍵詞：多重PCR；檢測；金黃色葡萄球菌；腸毒素AstudyonfastdetectionofsixkindsofStaphylococcusaureusenterotoxinsgeneswithamultiplexPCRmethodLIUJi-chao,JIANGTie-min,JIANGA-chi,CHENLi-jun*(BeijingSanyuanFoodsCo.Ltd.,Beijing,100076)Abstract:Objective:ToestablishamultiplexPCRmethodfordetectingSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenesofStaphylococcusaureusfastandhighlyeffectively.Methods:AccordingtoSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenesequencesofStaphylococcusaureusinGenBankandrelevantliteratures,sixpairsofspecificprimershadbeendesigned.EstablishedmultiplexPCRmethodsanditsreactionconditionswereoptimized.Results:Undertheoptimizedconditions,thesixfragmentsof120bp,478bp,257bp,319bp,170bpand375bpweresimultaneouslyamplifiedfromsixcoupleprimers.TheresultsshowedthatthePCRofsixpairsprimersweregoodspecifity.Conclusions:Asimple,rapidandsensitivemultiplexPCRmethodfordetectingsixkindsofS.aureusenterotoxingeneshasbeenestablished.ItcoulddetectSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenessimultaneously,therefore,theprospectoffastdetectionofStaphylococcusaureusenterotoxinisbrilliant.Keywords:multiplexPCR,detection,Staphylococcusaureus,enterotoxin金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，是國內外最常見的細菌性食物中毒病原體之一，該菌引起食物中毒的主要原因是產生葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxins，SEs)。根據其血清學特性，SEs可分為5型(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)，近幾年還報道了SEG、SEH、SEI、SKJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO、SEP、SEQ、SER、SET、SEU等新分型的腸毒素1-4。目前國內外通訊作者：陳歷俊，基金項目：“十一五”國家科技支撐計劃(2009BADB9B06)；北京市重點科技計劃項目(D1011050460000)作者簡介：劉繼超，男，1983年出生，碩士，乳品微生物。用于檢測SEs的方法按照檢測原理的不同，可分為生物學檢測方法、免疫血清學方法、聚合酶鏈反應技術、生物傳感器技術及超抗原技術等5-6。這些方法都存在一個問題：即一次實驗只能檢測一種病原菌。如采用多重PCR檢測，則既具有PCR簡便快速的特點，又能在同一反應體系中同時檢測多種SEs。本研究針對金黃色葡萄球菌腸毒素的6種血清型(A、B、C、D、E、H型)設計選擇特異性PCR引物，進行多重PCR檢測，建立一種快速一次性檢測6種腸毒素血清型的多重PCR檢測方法。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種標準菌株(見表1)分別購自中國藥品生物制品檢定所菌種保藏中心、中國微生物菌種保藏中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。表1試驗用標準菌株Table1Teststandardstrains菌名菌種編號金黃色葡萄球菌腸毒素AATCC-13565金黃色葡萄球菌腸毒素BATCC-14458金黃色葡萄球菌腸毒素CATCC-19095金黃色葡萄球菌腸毒素DATCC-23235金黃色葡萄球菌腸毒素EATCC-27664金黃色葡萄球菌腸毒素HATCC-51811單增李斯特菌ATCC-15313大腸桿菌ATCC-25922金黃色葡萄球菌CGMCC-1.0128沙門氏菌CGMCC-1.1552表皮葡萄球菌CGMCC-1.24291.1.2試劑溶菌酶、RNaseA、EDTA、SDS、NaCl、無水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇等均為國產分析純；瓊脂糖(SpainAgarose香港基因公司分裝)；TaqDNA聚合酶、dNTPs購自北京全式金生物技術有限公司；PCR染料、DNAMarkerB購自北京賽百盛基因技術公司。1.1.3儀器GeneAmpPCRSystem2400PCR儀(美國PE公司)，PAC300電泳儀(BIO-RAD公司)，TanonGIS2010凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)，離心機2K15(Sigma)，ThermopH計(美國)，LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。1.2方法1.2.1模板DNA的提取在無菌條件下，用滅菌處理的接種環(huán)分別挑取試驗用標準菌落，接種于5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜后培養(yǎng)基出現明顯混濁，即培養(yǎng)基中有大量菌體增殖。使用培養(yǎng)好的菌液進行金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取，提取菌體DNA方法見參考文獻7-8。1.2.2擴增引物設計參考有關文獻9-14設計選擇SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SHE的PCR引物，引物的序列及目的產物長度見表2。表2多重PCR引物的序列及目的產物長度Table2BasesequencesofthemultiplexPCRspecificoligonucleotideprimersandpredictedsizesofamplifiedproducts基因引物引物序列長度(bp)產物長度（bp）seaSEA-FTTGGAAACGGTTAAAACGAA20120SEA-RGAACCTTCCCATCAAAAACA20sebSEB-FTCACATCAAACTGACAAACG20478SEB-RGCAGGTACTCTATAAGTGCC20secSEC-FGACATAAAAGCTAGGAATTT20257SEC-RAAATCGGATTAACATTATCC20sedSED-FCTAGTTTGGTAATATCTCCTTTAAACG27319SED-RTTAATGCTATATCTTATAGGGTAAACATC29seeSEE-FTAGATAAAGTTAAAACAAGC20170SEE-RTAACTTACCGTGGACCCTTC20sehSEH-FCATTCACATCATATGCGAAAGCAG24375SEH-RCATCTACCCAAACATTAGCACC221.2.3多重PCR體系的建立利用從標準菌株中所提取的基因組DNA作為模板，通過每對引物單獨擴增其目的基因的常規(guī)PCR，盡量找出共同條件，統一條件后進行混合引物擴增多個模板的多重PCR，并摸索最佳反應條件。多重PCR反應體系為：模板DNA：6l(六種菌株DNA各1l)；25mol/l上下游引物：6l(六對引物各1l)；2.5mol/ldNTPs：3l；5U/lTaq酶：1.5l(5U/l)；10PCRBuffer：5l；PCR染料：5l，用無菌超純水補充至總體積50l。離心混勻后置PCR儀上進行自動化擴增反應，循環(huán)參數為94預變性4min；94變性1min；50退火45s；72延伸1min；共35個循環(huán)；最后72延伸10min，4保存。1.2.4特異性試驗分別用每對引物擴增其目的菌株及表1中其它所有菌株，觀察各對引物的特異性。同時應用6對引物擴增表1中的所有菌株，觀察多重PCR條件下引物的特異性并摸索最佳反應條件，然后對PCR擴增產物進行電泳檢測。2結果與分析2.1多重PCR特異性分析以提取的6種目標菌株DNA為模板，另外分別以沙門氏菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌提取的單一DNA為模板，同時加入6對引物進行擴增(見圖1)。結果表明，對照組金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌及陰性對照均沒有擴增現象，擴增結果見圖1。表明6對多重PCR引物對于擴增金黃色葡萄球菌腸毒素的6種血清型(A、B、C、D、E、H)具有較好的特異性。圖1多重PCR特異性分析Fig1SpecificityofmultiplexPCRanalysisM：DNAMarkerB；1：多重PCR的擴增產物；2：SEA的擴增產物120bp；3：SEB的擴增產物478bp；4：SEC的擴增產物257bp；5：SED的擴增產物319bp；6：SEE的擴增產物170bp；7：SEH的擴增產物375bp；8：金黃色葡萄球菌；9：表皮葡萄球菌；10：單增李斯特菌；11：大腸桿菌；12：沙門氏菌；13：陰性對照2.2多重PCR反應條件的優(yōu)化PCR反應的影響因素很多，其中1個重要參數就是退火溫度，其次還有Mg2+濃度、循環(huán)數等。首先利用PCR儀優(yōu)化退火溫度，在最佳的退火溫度下再根據條帶的亮暗調整Mg2+濃度，同時調整循環(huán)數，以便在最短的時間內達到最佳的效果。2.2.1退火溫度的優(yōu)化設置退火溫度梯度：46、47、48、49、50，使用3.0%的瓊脂糖凝膠電泳的結果見圖2。多重PCR的六條目的帶在退火溫度為48間時亮度最佳，故多重PCR的最佳退火溫度為48。圖2多重PCR退火溫度梯度結果Fig2TheresultsofmultiplexPCRannealingtemperaturegradientM：DNAMarkerB；1：退火溫度為46；2：退火溫度為47；3：退火溫度為48；4：退火溫度為49；5：退火溫度為502.2.2Mg2+濃度的優(yōu)化設置Mg2+濃度梯度為1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，電泳結果見圖3。Mg2+濃度為2.0mM時多重PCR的目的帶較好，故選Mg2+的最佳濃度為2.0mM。圖3Mg2+濃度梯度結果Fig3TheresultsofMg2+concentrationgradient1：Mg2+濃度為1.5mM；2：Mg2+濃度為2.0mM；3：Mg2+濃度為2.5mM；4：Mg2+濃度為3.0mM；M：DNAMarkerB；2.2.3循環(huán)數的優(yōu)化設置循環(huán)數梯度為32、35、38，電泳結果見圖4，可知循環(huán)數為35時的目的帶最好，故最佳循環(huán)數為35。圖4循環(huán)數梯度結果Fig4Theresultsofcyclesgradient1：循環(huán)數為32；2：循環(huán)數為35；3：循環(huán)數為38；M：DNAMarkerB3結論根據genebank報道的編碼金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E、H的基因序列，設計了6對PCR引物，目的片段的長度分別為120bp、478bp、257bp、319bp、170bp和375bp。多重PCR擴增結果表明6對PCR引物具有良好的特異性，并多重PCR反應條件的優(yōu)化，優(yōu)化結果為最佳退火溫度48、Mg2+的最佳濃度2.0mM、最佳循環(huán)數35。本研究成功地建立了簡單、快速的多重PCR方法，可以一次性檢測金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因，在金黃色葡萄球菌腸毒素快速篩查方面具有良好的應用前景。參考文獻1ZschockM,KloppertB,WolterW,etal.Patternofenterotoxingenesseg,seh,seiandsejpositiveStaphylococcusaureusisolatedfrombovinemastitisJ.VetMicrobiol,2005,108:243249.2LovsethA,LoncarevicS,BerdalKG.ModifiedmultiplexPCRmethodfordetectionofpyrogenicexotoxingenesinstaphylococcalisolatesJ.JClinMicrobiol,2004,42:38693872.3OmoeK,IshikawaM,ShimodaY,etal.Detectionofseg,seh,andseigenesinStaphylococcusaureusisolatesanddeterminationoftheenterotoxinproductivitiesofS.aureusisolatesHarboringseg,seh,orseigenesJ.JClinMicrobiol,2002,40(3):857-862.4RosecJP,GigaudO.StaphylococcalenterotoxingenesofclassicalandnewtypesdetectedbyPCRinFranceJ.IntJFoodMicrobiol,2002,77(1-2):61-70.5李紅云，施志國，姚詠明.金黃色葡萄球菌腸毒素和中毒性休克毒素檢測的研究進展J.國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2000，21(5)：247251.6向陽.食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢測方法J.中國食品學報，2002，2(2)：57-61.7J.S.Moon,A.R.Lee,H.M.Kang,etal.AntibiogramandCoagulaseDiversityinStaphylococcalEnterotoxin-ProducingStaphylococcusaureusfromBovineMastitisJ.JournalofDairyScience,2007,90(4):1716-1724.8SudhirTamarapu,JohnLMc,etal.DevelopmentofaMultiplexPolymeraseChainReactionAssayforDetectionandDifferentiationofStaphylococcusaureusinDairyProductsJ.JFoodProt,2001,64(5):664-668.9W.M.Johnson,S.D.Tyler,E.P.Ewan,etal.DetectionofGenesforEnterotoxins,ExfoliativeToxins,andToxicShockSyndromeToxin1inStaphylococcusaureusbythePolymeraseChainReactionJ.JournalofClinicalMicrobiology,1991,29(3):426430.10SophieJarraud,GregoireCozon,FrancoisVandenesch,etal.InvolvementofEnterotoxinsGandIinStaphylococcalToxicShockSyndromeandStaphylococcalScarletFeverJ.JournalofClinicalMicrobiology,1999,37(8):24462449.11ManishaMehrotra,GehuaWang,WendYM.Johnson.MultiplexPCRforDetectionofGenesforStaphylococcusaureusEnterotoxins