實驗三 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳,主講：姜婧怡 生物化學教研室,實驗目的：,掌握電泳的基本原理，加深對蛋白質兩性解離性質的理解。 掌握血清醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質的基本操作。,實 驗 原 理,電泳技術（Electrophoresis）,電泳的概念：帶電物質在電場中向相反電極移動的現象稱為電泳.,背景：電泳現象早在十九世紀初就已發現（1808年俄國物理學家Ress進行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術的廣泛應用，則是在1937年用濾紙作為支持介質成功地進行紙電泳以后，是近幾十年以來，電泳技術發展很快，各種類型的電泳技術相繼誕生，在生物化學、醫學、免疫學等領域得到了廣泛應用。,為了克服溶液對電泳離子的影響，一般在電泳體系中加入不流動的固體支持物。 （一）按支持物的物理性狀不同，可分為： 1濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、聚氯乙烯纖維薄膜、醋酸纖維)電泳 2粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳； 3凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳； 4絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。,電泳的分類,（二）按支持物的裝置形式不同，可分為：,1平板式電泳：支持物水平放置；,2垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；,3垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳,(三)按pH 的連續性不同，區帶電泳可分為： 1連續pH 電泳：即整個電泳過程pH 保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。 2非連續pH 電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH 的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等。,電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內粒子運動的速度，以u表示，即,V粒子運動的速度 X電場強度 Q粒子所帶電荷 r粒子的半徑 介質的粘度,影響電泳速度的主要因素,1.樣品本身: 分子帶電量：Q越多，u越大； 分子大小: 分子小，r越小，u越大； 分子形狀：形狀越小，與支持物介質摩擦 越小，u越大。 形狀越規則，u越大， 反之則越 小。 球形分子 纖維狀分子,2.緩沖溶液：,A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大,B.離子強度(I)： 離子強度代表所有類型的離子所產生的靜電力，也就是全部的離子效應，它取決于離子電荷的總數，而與溶液中鹽類的性質無關。溶液的離子強度越高，帶電質點的泳動速度越慢；離子強度越低，質點泳動的速度越快。,一般離子強度的選擇范圍在0.020.2之間。,3.電場強度(X):,電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。,X越大，u越快。 支持物越短， X越大， u越快。,注意：電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產熱也增加，影響分離效果。 在進行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質等樣品發生熱變性而無法分離。,電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。如紙電泳時，濾紙吸附OH-帶負電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負極移動，會對顆粒的移動造成不良影響，故電泳時，電滲小些為好。,4電滲現象,醋酸纖維薄膜電泳,醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經 乙酰化而成。涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結構，有強滲透性，厚度約為120微米。 醋酸纖維素薄膜電泳有以下優點： 微量、快速、簡便、分辨力高、 對樣品無拖尾和吸附現象,實驗原理,以蛋白質為例：,pHpI pH=pI pHpI,H,H,OH,OH,蛋白質兼性離子,蛋白質陽離子,蛋白質陰離子,（等電點）,實驗原理,以蛋白質為例：,實驗原理,人血清中幾種主要蛋白組分,緩沖液pH=8.6,pHpI,血清蛋白帶負電荷,在電場中向正極移動。,經醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區帶,染色和定量,膜條經過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。,各色帶蛋白質含量與染料結合量基本成正比。,可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中。,用分光光度法計算各種蛋白質的百分數。,實驗步驟：,1準備與點樣：,取一條2.58cm的膜條,充分浸透在巴比妥緩沖液中,取出膜條,濾紙吸去多余的緩沖液,無光面距一端1.5cm處作點樣線,點樣器下端粘上薄層血清,垂 直 點 樣,（注意：在薄膜負極端寫好學號或者做好標記),2電泳,放 置 膜 條,點樣端置于陰極,點樣面向下,膜條貼 緊濾紙，拉直膜條,平衡10 分鐘,通 電,電壓：160v,時間：50 min,關閉 電源,3染色、脫色,通電 完畢,取出 膜條,浸于染色液（氨基黑10B）中,3min,取出 膜條,依次浸于漂洗液、,各5min,直至 漂凈,濾紙吸 干薄膜,.定量 (兩人的膜條共用),取試管6支，編號16,充分振蕩、脫凈染料,比 色、定 量,15min,實驗結果：,原始數據：,各樣品吸光度值,儀器型號： 吸收波長：,650nm,光密度總和 T2A12,1計算出各部分蛋白質占總蛋白質的百分數。 清蛋白（2A / T）100 1球蛋白（ 1 / T）100 2球蛋白（ 2 / T）100 球蛋白（/ T）100 球蛋白（/ T）100,2計算出清蛋白與球蛋白之比值（2A/G） G=12,血清蛋白電泳結果的臨床意義：,臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關系： 正常人A/G1.52.5,注意事項：,1、點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。 2、點樣時，動作要輕、穩，用力不能太大，以免損壞膜 片或印出凹陷影響電泳區帶分離效果。 3、點樣應點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。,4、電泳時應將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且點樣面向下。 5、應控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區分，或造成條帶染色不均勻。,下次實驗： 血清-球蛋白的提純,預習要點： 1.鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白 質的基本原理及操作 2.蛋白質定性檢測的方法。 3.離心機的原理及操作。,后面內容直接刪除就行 資料可以編輯修改使用 資料可以編輯修改使用 資料僅供參考，實際情況實際分析,主要經營：課件設計，文檔制作，網絡軟件設計、圖文設計制作、發布廣告等 秉著以優質的服務對待每一位客戶，做到讓客戶滿意！ 致力于數據挖掘，合同簡歷、論文寫作、PPT設計、計劃書、策劃案、學習課件、各類模板等方方面面，打造全網一站式需求,感謝您的觀看